Том 2 (1109662), страница 42
Текст из файла (страница 42)
Анализ материалов 225ия#,в\висимость производной скорости счета dN(E)/dEэлектронов E.от энергии оже-(а)UE200400600-JJf)Yf-:,JH''41«'I•800энергия электронов, эВ(б)• UN(E)"BHnJid£с(\NiIrJPNiNiСгСгIчи f . • т\кан •:Si200I400I600I800энергия электронов, эВX;0,Р и с . 8.15. Оже-электронный спектр .кремниевой подложки, покрытой слоем никеля и хрома, (а) — Спектр поверхности, (б) — Спектрпосле стравливания слоя толщиной около 200 А.Наряду с линиями основных элементов покрытия Ni и Cr отчетливо заметны линии кислорода.
На рис. 8.15 (б) приведен спектртого же образца, покрытие с которого удалено посредством ионноготравления. Сигналы Ni и Cr теперь значительно слабее. Наблюдается интенсивный пик элемента подложки — кремния. Использование8—1150226Глава 8. Специальныевопросыаналитическойхимииоже-электронной спектроскопии в сочетании с ионным травлениемпозволяет получать профили распределения элементов по глубине(рис. 8.16). Для этого сначала строят зависимости интенсивностейпиков от времени травления, а затем по известной скорости травления пересчитывают значения времени в значения глубины.О—•50--1001'150• ••200250глубина,АР и с . 8.16.
Концентрационные профили распределения элементов по глубине кремниевой подложки, покрытой слоем Ni и Cr. Рассчитаныпо данным оже-электронного микрозондового анализа.8.3. Ферментативные и иммунохимическиеметодыМетоды определения ферментов, их субстратов и антител имеютряд особенностей, которые мы обсудим в этом разделе. С задачами определения такого рода веществ приходится сталкиваться нетолько в исследовательских лабораториях.
Они относятся к числуповседневных задач медицинской диагностики, фармацевтическойи микробиологической промышленности.С биохимическими методами анализа мы уже встречались и ранее в частности, при обсуждении проблем, связанных с анализомобъектов окружающей среды. Основное достоинство биохимическихметодов — высокая селективность, обусловленная специфичностьюферментативных и иммунных процессов.Ферментативные методы анализаФерменты в аналитической химииФерменты — это белковые биологические катализаторы с относительными молекулярными массами от 10 000 до 2000 000 дальтон.8.3.
Ферментативныеи иммунохимическиеметоды227Они состоят из аминокислотных цепей, в которых остатки аминокислот связаны пептидными связями. Многие ферменты проявляютсвое действие, только будучи связаны с кофактором. Чтобы различить действующий фермент и его белковую часть, используюттермины «холофермент» и «апофермент», соответственно.+апоферментHUкофактор';\(8.9)холоферментv» B качестве кофакторов могут выступать:^4N.\• ионы металлов — Zn 2 + в алкогольдегидрогеназе и карбоксипептидазе, Mn 2 + в фосфортрансферазе, ионы железа в цитохромах;• органические молекулы — коферменты (коэнзимы), напри|1\| у мер, НАД + (рис.
8.17), переносчик гидроксильных групп и электронов, или коэнзим А, переносчик ацильных групп.П I .Hl,4 : ,':никотинамидN0r^-L/L^Xbcу*^^\„-<Г->-^4*п'он H O ^ c . o / ^ 0 - V c H r < .•/ ^ГЧ-Г"-NаденинпирофосфатОН НОрибозаР и с . 8.17. Структурная формула кофермента никотинамидадениндифосфата (НАД+).^ "Кинетика ферментативных реакцийВ организме ферменты выполняют роль катализаторов биохимических реакций. В присутствии фермента энергия активации значительно снижается, и скорость реакции возрастает во много раз.-< В аналитической химии каталитические реакции применяются вкинетических методах анализа (раздел 2.7). Весь математическийаппарат формальной кинетики, используемый в этих методах, может быть применен и к ферментативным реакциям.
Одна из особенностей ферментативных реакций — явление насыщения по субстрату, т.е. наблюдаемое при некоторых условиях отсутствие зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.Формально реакция при этом имеет нулевой порядок. Рис. 8.18 иллюстрирует это явление. Если представить графически зависимость228Глава8. Специальныевопросыаналитическойхимииначальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата, то при небольших концентрациях наблюдается линейная зависимость (первый кинетический порядок), далее порядок реакциистановится промежуточным между первым и нулевым и, наконец,при высоких концентрациях субстрата наблюдается нулевой порядок.Объяснить насыщение посубстрату можно с позицийкинетической теории ферментативных реакций, разработанной Михаэлисом иМентен.
В соответствии сэтой теорией фермент E реагирует с субстратом S собразованием продукта Pсогласно следующей схеме:концентрация субстрата S-ншМвн Атмл:E + S ^ ES,(8.10)Р и с . 8.18. Влияние концентрации субстраfc_iта на начальную скорость ферментативнойреакции.*2.E + P.(8.11)На первой, обратимой, стадии образуется комплекс фермента с субстратом. Послевторой стадии фермент высвобождается (ср. с уравнениями (2.182) и (2.183) в разделе 2.7).
На рис. 8.19 показаноизменение концентраций отдельных участников реакцииво времени.времяВыразим начальную скорость ферментативной реак Р и с . 8.19. Примерный ход изменения конции через концентрации фер центраций фермента E, субстрата S, промента и субстрата. В со дукта реакции P и промежуточного комответствии с общей теори плекса ES во времени в соответствии с кинетической схемой Михаэлиса-Ментен.ей формальной кинетики скорость образования продукта реакции выражается какESv0 = Ar2[ES].(8.12)л Примем, что концентрация промежуточного комплекса ES является стационарной, т.е. не изменяющейся во времени.
Скорость8.3. Ферментативные и иммунохимические методы 229образования комплекса равна«1 = fci [E][S].(8.13)Скорость распада комплекса равна„.,.V2 = -*_![ES] -A 2 [ES].(8.14)Ввиду допущения о стационарности общая скорость изменения концентрации комплекса равна нулю:i b " --V •:•;•..ЁИ = Vl +V2 = o.atПодставляя (8.13) и (8.14) в (8.15), получаем:...(8.15)A1[E][S] = ^ 1 [ E S ] + A2[ES].(8.16)ОТ--, ' r f - A .?' '•-.Общая концентрация фермента с# равнаmm;СЕ = [E] + [ES].(8.17)Подставим это соотношение в выражение (8.16):*AI[S](CE-[ES])= fc_i[ES] + A2[ES].(8.18)Введем величину Км, называемую константой Михаэлиса-Ментен:_ А_!+A 2[S](CE-[ES])Км~ ~кГ~~[ES](819)'Решив уравнение (8.19) относительно [ES], получаем:"--Л-Км + IbJОтсюда начальная скорость образования продукта ферментативнойреакции (см. уравнение (8.12)) равна)$A-.,COOH| НRN-HC"^|+COOHCH 2аспарагиноваякислотаCOOHICOOHO=CII^°~сCH2 = = ^I +COOHICH2COOHа-кетоглутароваякислотащавелевоуксуснаякислотаCOOHIH 2 NHCICH2IICOOHглутаминоваякислота230Глава 8.
Специальные вопросы аналитической химииПримеры значений констант Михаэлиса-Ментен приведены втабл. 8.5. Ниже мы обсудим использование уравнения (8.21) для определения как ферментов, так и субстратов.Таблица 8.5.\ t- I - Ii -M HH!' н,_,^'••J),Константы Михаэлиса-Ментен для некоторых аналитически важных ферментативных реакций.ФерментСубстратКм, мМКаталазаН2О225Гексокиназаглюкоза0,15Глутаматдегидрогеназаглутамат0,12Определение ферментовЕсли концентрация субстрата достаточно велика, [S] > > Км, тоуравнение (8.21) упрощается:fMS-V-::.,V0 = Vmax = к2СЕ.(8.22)В этих условиях скорость реакции максимальна и зависит толькоот концентрации фермента, но не субстрата (упоминавшееся вышеявление насыщения по субстрату).
Таким образом, измерение скорости реакции можно использовать для определения концентрациифермента. Примером может служить определение фермента GOT —одного из ферментов класса трансаминаз, катализирующего реакциюTG O T,L-аспарагиновая кислота + а-кетоглутаровая кислотаGOT^>(8т'23)> щавелевоуксусная кислота + L-глутаминовая кислота.Концентрация этого фермента в сыворотке крови человека является очень важным диагностическим параметром, характеризующимпротекание процессов метаболизма аминокислот.Определение субстратовДля определения субстратов следует использовать область концентраций [S] < < Км- В этом случае уравнение (8.21) превращается вV0 = ^i= ^ L [ S ] = const • [S].(8.24)KuКмОпределение субстратов при помощи ферментативных реакцийшироко применяется в клиническом, производственном, экологическом анализе и других областях (табл.
8.6).8.3. ФерментативныеТаблица 8.6.Субстрати иммунохимическиеметодыПримеры использования ферментативныхопределения субстратов.231реакций дляФерментативная реакцияФермент-катализаторГлюкозаглюкоза + Ог + НгО ^^ D - глюконолактон + НгОгглюкозооксидазаЭтанол(в крови)этанол + Н А Д + ^?=± ацетальдегид + НАДНалкогольдегидрогеназаПенициллинпенициллин + НгО ^^ пенициллиновая кислотапенициллиназаКатехолкатехол + Ог ^R=± дикарбоновая кислотакатехол-1,2-оксигеназафенол + Ог ^;=± о-бензохинонполифенолоксидазаМедицина:Промышленность:Экология:ФенолСпособы детектированияВ некоторых случаях ход протекания ферментативных реакций можно контролировать непосредственно, следя за изменением концентрации любого из ее участников.
Так, для измерения скорости любой реакции с участием кислорода можно использовать кислородный датчик Кларка, а с участием иона аммония — соответствующий ионселективный электрод.Однако значительно чаще используют химические индикаторыили дополнительные реакции, называемые индикаторными или вспомогательными. Так, для окислительно-восстановительных реакций в качестве индикатора можно использовать кофермент НАД"1" (рис.
8.17),поскольку УФ-спектры его окисленной (НАД + ) и восстановленной(НАДН) форм заметно различаются.HHОIRНАД4OXANH,чNHH+ 2е4NH 2(8.25)"vTNIRНАДНУФ-спектры обеих форм НАД + приведены на рис. 8.20. Для фотометрического контроля наиболее удобна длина волны 340 нм.232Глава 8. Специальные вопросы аналитической химииНАДНетш-BR8K-250300400длина волны,нм350Рис.
8.20. Спектры поглощения в УФ-области водных растворов Н А Д + иНАДН.Применение индикаторных реакций мы рассмотрим на примереопределения глюкозы при помощи глюкозооксидазы (табл. 8.6). Одним из продуктов этой реакции является пероксид водорода. Введемв систему дополнительный реагент — о-дианизидин. Он бесцветен,однако в присутствии пероксида водорода превращается в окрашенный продукт вследствие реакцииФ:H3C-OP-CH 3нзс_°чЯ_СНзH 2 O + HNH2O2восстановленная форма(бесцветная)NHокисленная форма(красная)(8.26)Продукт окисления — диимин — интенсивно поглощает свет при460 нм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
