Том 2 (1109662), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Внешний же слой мицелл заряжен. Поэтому в электрическом поле мицелла перемещается, унося с собойзахваченную внутрь нейтральную молекулу (рис. 5.47).Метод разделения нейтральных молекул в электрическом полепри помощи мицелл называется мицеллярнойэлектрокинетическойкапиллярной хроматографией. Слово «хроматография» в названииметода не случайно. В отличие от всех остальных рассмотренныхнами электрофоретических методов, здесь разделение веществ, как5-4- Сверхкритическая флюидная хроматография и электрофорез IОIи в хроматографии, основано на распределительном равновесии сучастием двух (псевдо)фаз — мицеллярной (аналог подвижной фазыв хроматографии) и фазой раствора (аналог неподвижной фазы).Применение электрофоретических методовКлассический электрофорез (в «макроскопическом» масштабе) является одним из самых распространенных аналитических методов вбиологии и биохимии, поскольку биомолекулы в большинстве случаев заряжены.
Как правило, здесь применяют электрофорез на полимерном носителе. Использование носителя значительно уменьшаетнежелательное влияние тепловых конвекционных потоков. Однакометоды классического электрофореза с трудом поддаются автоматизации и поэтому часто оказываются длительными и трудоемкими.Применение капиллярного электрофореза позволяет устранитьсамые главные проблемы метода — тепловую конвекцию и трудности детектирования. Капиллярный электрофорез — высокоэффективный метод, широко применяемый для определения аминокислот, пептидов, белков, нуклеиновых кислот и других биополимеров.
Так, смесь фрагментов ДНК можно проанализировать за10 мин, используя капилляр длиной 35 см и внутренним диаметром50 мкм в среде боратного буфера при напряжении на электродах8 кВ с фотометрическим детектированием при 260 нм. При помощиклассического электрофореза на полиамидном геле такой же анализзанимает около трех часов.На рис. 5.48 приведены две электрофореграммы смеси белков.При использовании кварцевого капилляра с немодифицированнымивнутренними стенками (рис. 5.48 (а)) необходимо использовать достаточно высокую концентрацию буферного раствора, чтобы предотвратить адсорбцию разделяемых веществ на стенках капилляра.При внимательном рассмотрении электрофореграммы видно, чтопики несимметричны и имеют «хвосты».
Если же поверхность капилляра покрыть поливиниловым спиртом (рис. 5.48 (б)), то пикистановятся симметричными. В данном случае при эффективной длине капилляра 57 см число теоретических тарелок составляет около1000 000.Методом электрофореза можно определять и низкомолекулярные ионы, в частности, катионы и анионы, содержащиеся в биологических жидкостях. Диапазон линейности зависимости сигналадетектора от концентрации в этих случаях составляет обычно трипорядка и выше.102 Глава 5.
Хроматографические и родственные методыПрименение мицеллообразования позволяет определять методоммицеллярнои электрокинетической хроматографии и нейтральныемолекулы. Это используют при анализе объектов окружающей среды, например, для определения фенолов.34LJ510время миграции, мин510время миграции, минРис. 5.48. Анализ смеси белков методом капиллярного электрофореза сиспользованием немодифицированного капилляра (а) и капилляра, покрытого слоем поливинилового спирта (б). 1 — цитохром, 2 — лизоцим, 3 — трипсин, 4 — трипсиноген, 5 — ахимотрипсин. Капилляр: эффективная длина 57 см, общая длина70 см, внутренний диаметр 50мкм. Буфер: фосфатный, рН 3,150мМ (а), 50мМ (б).
Напряжение 30кВ. Ввод пробы: электрокинетический, 15 кВ, 5 с. Детектирование: УФ, 214 нм.5.5. Сочетание хроматографии испектроскопииСочетание нескольких методов анализа в одно целое позволяет резко увеличить объем извлекаемой информации о веществе. В данном разделе мы рассмотрим те дополнительные возможности, которые открываются в результате сочетания методов хроматографиии спектроскопии.Одновременное использование этих двух методов позволяет получать данные в виде зависимости интенсивности сигнала одновременно от времени удерживания и длины волны. Графически ееможно представить в форме трехмерной диаграммы (рис.
5.25).5.5. Сочетание хроматографии и спектроскопии 103Возможности сочетания отдельных методов хроматографии испектроскопии представлены в табл. 5.15. Сочетание газовой хроматографии с масс-спектрометрией и жидкостной хроматографиис УФ-спектроскопией используется повсеместно. Постепенно возрастает и роль комбинации жидкостная хроматография — массспектрометрия, а также применение атомно-эмиссионной спектроскопии с различными источниками возбуждения в сочетании с газовой и жидкостной хроматографией. Наиболее важные комбинациихроматографических и спектроскопических методов будут подробнее рассмотрены ниже.Таблица 5.15.
Возможности сочетания хроматографических и спектроскопических методов. + - Hиспользуется повсеместно,-Hиспользуется часто, Hпринципиально возможно.ХроматографияСпектроскопияГХ+++++MCВЭЖХУФикAACАЭС++++++++++ГХ — газовая хроматография, ВЭЖХ — высокоэффективная жидкостная хроматография, MC — масс-спектрометрия, УФ — УФспектроскопия, ИК — ИК-спектроскопия, AAC — атомно-абсорбционная спектроскопия, АЭС — атомно-эмиссионная спектроскопия.Сочетание газовой хроматографии имасс-спектрометрииТехническая реализацияДля капиллярной газовой хроматографии объединение хроматографаи масс-спектрометра не встречает технических трудностей.
В этомслучае скорость потока газа-носителя (1-25 мл/мин) достаточно мала, и выходящий газовый поток можно непосредственно вводить вионизационную камеру масс-спектрометра.При использовании набивных колонок поток газа слишком велики не может быть введен в вакуумированную систему масс-спектрометра непосредственно. Поэтому между колонкой и масс-спектрометром устанавливают сепаратор.Действие сепаратора основано на принципе молекулярных пучков. Наиболее распространенная конструкция сепаратора представлена на рис.
5.49. Поток газа из колонки поступает через сопло вГлава5. Хроматографическиеи родственныеметодыкамеру, из которой непрерывно откачивается газ. При этом преимущественно откачиваются молекулы газа-носителя как более легкие. Поэтому газовая среда относительно обогащается (примернона 50%) молекулами определяемого вещества. Часть разреженногогазового потока через трубку-переходник поступает в ионизатормасс-спектрометра.разделяющая камерао о°п•> О•n ,OЧ„•f г0"о o.n.°>&-0°.0...о*о» 0/оNо\Iтрубка-переходнико °о*о ° оо„ источник ионов. • —>масс-спектрометра/вакуумный насосР и с . 5.49.
Сепаратор для соединения набивной газо-хроматографическойколонки и масс-спектрометра. Темные кружки — молекулыопределяемого вещества, светлые кружки — молекулы газаносителя.Обычно в сочетании с газовой хроматографией используют квадрупольные или секторные магнитные масс-анализаторы. Соответствующие приборы — хромато-масс-спектрометры — серийно выпускаются промышленностью.Регистрация масс-хроматограммВ ходе хроматографического разделения с масс-спектрометрическим детектированием можно регистрировать полный ионный ток —сумму ионных токов, отвечающих всевозможным массовым числам —как функцию от времени удерживания.Можно также настроить масс-спектрометрический детектор наодно или несколько определенных значений массового числа и непрерывно регистрировать соответствующие ионные токи (селективный мониторинг ионов).
Преимуществом этого способа являетсявозможность более длительной регистрации, что увеличивает чувствительность определения.Для одного пика или всей хроматограммы в целом можно регистрировать и полный масс-спектр. Обработку и графическое представление полученной масс-хроматограммы обычно осуществляют5.5. Сочетание хроматографии и спектроскопии 105при помощи компьютера. В частности, масс-хроматограмму можнопредставить в виде набора отдельных масс-спектров и идентифицировать вещества, пользуясь библиотекой масс-спектров.Практическое применениеСочетание газовой хроматографии и масс-спектрометрии — оченьмощный метод идентификации органических веществ по их массспектрам. Этим методом можно анализировать пробы сложного состава — природные и сточные воды, продукты питания (в частности, для определения вкусовых и ароматических добавок), определять различные метаболиты в биологических жидкостях.Путем сравнения масс-спектров, зарегистрированных на краях пика, можно судить о том, насколько этот пик соответствует индивидуальному веществу и, таким образом, о полноте хроматографического разделения.
Часто для контроля полноты разделения вычисляют отношения интенсивностей характерных массспектрометрических пиков при определенных массовых числах. Приполном разделении эти отношения должны быть постоянны на всемпротяжении хроматографического пика.Сочетание жидкостной хроматографии имасс-спектрометрииКак и для газовой хроматографии, для ВЭЖХ масс-спектрометрическое детектирование представляет интерес в первую очередь вплане расширения возможностей идентификации веществ в многокомпонентных смесях.
Однако ввиду использования достаточнобольших объемов жидкой фазы в ВЭЖХ непосредственный вводпотока элюата в вакуумную систему масс-спектрометра, как правило, невозможен. Некоторую часть потока можно ввести в массспектрометр непосредственно лишь при использовании микрокапиллярных колонок, для которых скорость потока жидкой фазы составляет от 10 до 50мкл/мин. Во всех остальных случаях необходимоприменять специальные устройства сопряжения.Одним из первых таких устройств была движущаяся лента-транспортер, при помощи которой поток жидкости, выходящий из колонки, поступал в нагревательную камеру, где растворитель испарялся.Затем пробу переносили в ионизационную камеру масс-спектрометра и ионизировали ее при помощи десорбционных методов.В настоящее время для определения неполярных и умеренно полярных веществ чаще всего применяют струйный интерфейс. По-106Глава 5.
Хроматографические и родственные методылярные соединения определяют, используя термораспыление или химическую ионизацию при атмосферном давлении. Для определениявысокополярных, ионных и высокомолекулярных веществ используют электрораспыление.Сопряжение при помощи пучка частиц (струйный интерфейс)Устройство струйного интерфейса напоминает сепаратор для сопряжения газового хроматографа и масс-спектрометра (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
