Том 2 (1109662), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Поэтомугель-хроматографию можно использовать и в препаративных целях.С другой стороны, и вещество не оказывает никакого воздействияна колонку, что нередко наблюдается в других видах хроматографии.Недостатки гель-хроматографии. Ввиду ограниченности диапазона значений К (между 0 и 1) максимальное число разрешенныхпиков в гель-хроматографии относительно невелико (см. табл. 5.4).80Глава5. Хроматографическиеи родственныеметоды(а)К=0,18«=0,52(б)891011удерживаемый объем, мл(В)kJ "vSI \5&Рис.ILЛ.S67Ii!I891011удерживаемый объем, мл5.37. Удерживание веществ и калибровка колонки в гельхроматографии.
(а) Гель-хроматограмма смеси стандартныхвеществ с относительными молекулярными массами от 106до 103 и коэффициентами распределения от 0 до 1. Последний, пятый, пик принадлежит веществу, испытывающемуфизико-химические взаимодействия с неподвижной фазой.(б) Билогарифмическая зависимость между удерживаемыми объемами и относительными молекулярными массамистандартных веществ, полученная по данным рис.
5.37(a).(в) Определение молекулярных масс неизвестных веществ.Все условия хроматографического процесса (объем пробы,скорость потока элюента и др.) должны быть строго идентичныусловиям калибровки.« % 4 J W 3 « : З*'>М«,Г.~>*75.3. Жидкостная хроматографияЭтим методом невозможно разделить молекулы одинакового размера, в частности, изомеры.
Обычно считают, что удовлетворительного разделения двух веществ можно достичь лишь в случае, еслиих молекулярные массы различаются не менее, чем на 10%.5.3.4. Тонкослойная хроматография: плоскостнойвариант жидкостной хроматографииАВ предыдущих разделах, посвященных жидкостной хроматографии,мы рассматривали исключительно ее колоночный вариант. В этомразделе мы коснемся методов плоскостной хроматографии, в которых регистрируют внутренние хроматограммы (см. раздел 5.1).К плоскостным методам относятся бумажная и тонкослойная хроматографии, а также электрохроматография.Плоский носитель неподвижной фазы может использоваться непосредственно (полоска бумаги в бумажной хроматографии) илибыть нанесен в виде тонкого слоя на пластинку (из стекла, пластмассы, металла).
Движение подвижной фазы может обеспечиватьсякапиллярными, гравитационными или электромиграционными силами.Мы ограничимся рассмотрением лишь наиболее распространенного метода плоскостной хроматографии — тонкослойной хроматографии (TCX). Метод TCX может рассматриваться как модифицированный вариант колоночной жидкостной хроматографии. Оченьчасто эксперименты по тонкослойной хроматографии являются предварительным этапом разработки методик колоночной хроматографии, поскольку они более просты в выполнении и позволяют за короткое время опробовать большое число подвижных фаз и разнообразные условия разделения.Тонкослойная хроматография широко используется для обзорного анализа в химических, производственных, медицинских, фармацевтических, биохимических и биологических лабораториях.Неподвижные и подвижные фазыВ тонкослойной хроматографии используют те же неподвижные фазы, что и в соответствующих методах колоночной ВЭЖХ — адсорбционной, распределительной (нормально-фазовой и обращеннофазовой), ионообменной, молекулярно-эксклюзионной.
Слой тонкоизмельченного носителя наносят на пластинки размерами 5 х 10,10 х 20 или 20 х 20 см. Для стандартных пластинок толщина слояносителя составляет 200-250 мкм, а размеры частиц носителя —82Глава5. Хроматографическиеи родственныеметоды20 мкм и более.
При длине разделяющего пути 12 см число теоретических тарелок может достигать 2000, а время разделения составлять порядка 25 мин.Современным методом TCX является высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ). В этом методе толщина слояносителя составляет порядка 100 мкм, а размер зерен — 5 мкм и менее. Разделение происходит более полно и за более короткое время,около 10 мин. При длине разделяющего пути 3 см число теоретических тарелок достигает 4000. Однако емкость неподвижной фазыи, соответственно, максимальное количество пробы в этом случаесущественно меньше.Нанесение пробы и получение хроматограммНанесение пробы (в виде раствора с концентрацией от 0,01 до 0,1%)на пластинку проще всего осуществить при помощи капилляра.
Объем раствора составляет от 0, 5 до 5 мкл. Каплю раствора наносятна расстоянии 1-2 см от края пластинки. Для качественного анализа диаметр образовавшегося пятна раствора не должен превышать5 мм, для количественного он должен быть еще меньше. В ВЭТСХобычно используют капилляры из сплава платины с иридием, прииспользовании которых объем капли раствора составляет от 100до 200 нл. Этот объем можно достаточно точно дозировать. Посленанесения капли раствора необходимо полностью испарить растворитель.Для получения хроматограммынеобходимо обеспечить движениеподвижной фазы вдоль пластинки.пластинкаДля этого пластинку помещают в закрытую хроматографическую каметонкий слои носителяру (рис. 5.38).
На дно камеры наливают немного растворителя — порастворительдвижной фазы и насыщают ее паРис. 5.38. Хроматографическаякамера для тонкослойной хроматографии.р а м ио б. П р и у с т а н о в к е п л а с т и н к и не^м о ^ч т о б ы п я т н о п р о .бы не касалось жидкого слоя растворителя. Под действием капиллярныхсил растворитель начинает перемещаться вверх по пластинке. Однако скорость его движения неравномерна.
Зависимость скоростидвижения растворителя от пройденного пути выражается гиперболической функцией.M^ тъы-5.3. Жидкостная хроматографияПосле того, как растворитель пройдет примерно две трети длины пластинки, пластинку вынимают из камеры. На этом получениехроматограммы заканчивается. После этого растворитель высушивают и детектируют пятна компонентов пробы.ДетектированиеВ ходе предварительных, обзорных, анализов, как правило, ограничиваются визуальным детектированием с целью идентификациикомпонентов смеси.
Для определения положения пятен компонентов пробы существуют следующие способы.ОIlсОНOCXононингидрин• Использование люминесцентных свойств разделяемыхвеществ. Для органическихвеществ, как правило, наблюдают флуоресценцию, длянеорганических — фосфоресценцию (см. раздел 3.3.3).R-NH2ОО• Нанесение флуоресцентносиний продукт реакцииго индикатора на носитель. При облучении пла Рис. 5.39. Образование продукта,окрашенного в синий цвет, пристинки ультрафиолетовым взаимодействии нингидрина с NH2пятна компонентов наблю группами.даются как темные, не флуоресцирующие области на общем светящемся фоне пластинки.В качестве индикаторов можно использовать производные пирена, флуоресцеин, морин, родамин Б.• Опрыскивание пластинки раствором неспецифического сильного окислителя — HNO3, KM11O4, а также концентрированной серной кислотой.
В результате окисления органическихвеществ на пластинке будут наблюдаться темные пятна.• Опрыскивание раствором группового или селективного реагента, образующего с соединениями определенных классовокрашенные продукты: нингидрина в качестве реагента на!ЧНг-группы (рис. 5.39), хлорида железа(Ш) как реагента наГлава 5. Хроматографические и родственные методы*фенолы, анилинфталата для проявления пятен некоторых Сахаров или лигандов, образующих окрашенные комплексы, —для проявления пятен ионов металлов.Идентификацию вещества на основании положения его пятнаможно осуществить очень легко, если одновременно с пробой натой же пластинке для сравнения провести хроматографированиеиндивидуальных предполагаемых веществ. При этом в случае использования проявляющих реактивов должны совпасть не толькоположения пятен, но и их окраска.
Более подробно о способах идентификации веществ на основании положения их пятен мы поговоримниже.Среди инструментальных методов детектирования преобладаетизмерение интенсивности локального диффузного отражения света в УФ- или видимой области.
Предназначенный для этого приборназывается денситометром или сканнером. Кроме того, можно послойно снимать носитель с пластинки и анализировать его отдельные порции обычными методами химического анализа, напримерспектроскопическими.Величина Rf и коэффициент емкостилиния стартуфронтрастворителяпройденное расстояние, смДля количественной характеристики удерживания веществ навнутренних хроматограммах, ккоторым принадлежат тонкослойные, используются специальные параметры.
Основным является коэффициент удерживания,обозначаемый (и чаще всего таки называемый) i?f. Он представляет собой отношение расстояний, пройденных на пластинке данным веществом (ZR) иР и с . 5.40. К расчету характеристик, ф р о н т о м ПОДВИЖНОЙ ф а з ыудерживания в тонкослойной хроматог дг>\.графии.R1 = ^ .(zM;(5.49)Для симметричных пятен 2¾ находят по положению центра пятна,для несимметричных — по положению максимума интенсивности.Выразим связь между величиной R$ и коэффициентом емкости.Для этого сначала найдем, за какие времена £ м и £R фронт раство-iv%kif-> ч • •• '-:•5.3.
Жидкостная хроматографиярителя и вещество пройдут одно и то оке определенное расстояние,скажем равное ZR. Пусть средняя линейная скорость движения растворителя равна й. ТогдаtM = ^ (5.50)иВещество проходит расстояние ZR за то же самое время, за какоефронт растворителя проходит расстояние ZM- Поэтому*R = ^ (5.51)иПодставляя выражения (5.50) и (5.51) в формулу для расчетакоэффициента емкости (5.9), получаем:k' = ^ - ? * .(5.52)Отсюда к' выражается через Rf следующим образом:1 _ :2В.1 __Rк' = —-£*L = i—f*.Ri(5.53)Далее, выразив к' через коэффициент распределения К и фазовое отношение (5 (уравнение (5.6)), получаем следующее соотношение:R< = ITP = I + W(5 54)'Величину расстояния, пройденного веществом, можно использовать для расчетов числа теоретических тарелок и высоты, эквивалентной теоретической тарелке.
Для тонкослойной хроматографиисоответствующие выражения выглядят следующим образом.Число теоретических тарелок: N = 16 ( — ) .\w JВысота, эквивалентная теоретической тарелке: H = —.(5.55)(5.56)Применение тонкослойной хроматографииМы уже упоминали о важной сфере применения тонкослойной хроматографии как очень простого в исполнении метода обзорногоанализа в самых разнообразных областях. Дополнительным достоинством TCX является возможность одновременного анализа нескольких проб на одной и той же пластинке.Глава 5. Хроматографические и родственные методы,:,; Для качественного анализа можно использовать характеристики удерживания, а также данные, полученные при помощи инструментального детектирования (в случае его применения).Отметим, что непосредственное использование абсолютных значений Rf для идентификации веществ, как правило, невозможно,поскольку эти значения сильно зависят от конкретных условий эксперимента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
