Том 2 (1109662), страница 17

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 17)

5.14) позволяют варьиро­вать температуру и давление в широких пределах, совместимыхс техническими возможностями обычной аппаратуры для ВЭЖХ.Иногда в подвижную фазу добавляют модификатор — небольшиеколичества метанола или диоксана. Другие вещества, используемыекак подвижные фазы в СФХ, перечислены в табл. 5.14.ДетекторыДетектирование в газовом потоке, выходящем из дросселя давления,можно осуществить при помощи обычного пламенно-ионизационногодетектора для газовой хроматографии.

Условием его применимостиявляется низкая величина фонового сигнала, что имеет место прииспользовании в качестве подвижной фазы СОг, N2O или NH3.По сравнению с жидкостной хроматографией в СФХ техниче­ски проще реализовать сочетание хроматографического разделенияи масс-спектрометрического детектирования. В сверхкритическойхроматографии масс-спектрометрическое детектирование применя­ется более широко, чем в жидкостной.

Используют также фотоме­трические детекторы в УФ- и ИК-области, флуоресцентные, пла­менно-фотометрические детекторы, а также катарометры и детек­торы электронного захвата (см. раздел 5.2).5.4- Сверхкритическая флюидная хроматография и электрофорез91Показатели эффективности С Ф ХИз сопоставления характеристик сверхкритических флюидов, газови жидкостей (табл. 5.13) можно сделать два основных вывода.Поскольку вязкость флюидов меньше, чем жидкостей, в СФХможно использовать более высокие скорости потоков подвижнойфазы, чем в ВЭЖХ (рис. 5.42). Времена выполнения анализа в СФХтакого же порядка, как и в газовой хроматографии, и существенноменьше, чем в жидкостной.С точки зрения величин коэффициентов диффузии флюиды за­нимают промежуточное положение между газами и жидкостями.Поэтому уширение пиков в сверхкритической хроматографии вы­ражено сильнее, чем в жидкостной, но слабее, чем в газовой хрома­тографии.Сравним зависимости вы­соты, эквивалентной теоре­тической тарелке, от линей­ной скорости потока подвиж­ной фазы для сверхкритиче­ской и жидкостной хромато­графии (рис.

5.42). Начнем свеличин В ЭТТ. При однойи той же линейной скоростипотока, равной 0, 6 см/с, для0,20,40,6 0,8СФХ ВЭТТ равна 0,13 мм, аU, см/сдля ВЭЖХ — 0,39 мм, т.е.Рис. 5.42. Сравнение зависимостей в три раза больше. Как сле­ВЭТТ (H) от линейной скорости потока дует из уравнения (5.17), этоподвижной фазы (и) для ВЭЖХ и СФХ означает, что при одних и тех(подвижная фаза — диоксид углерода).же условиях хроматографические пики в С Ф Х в \ / 3 раза уже, чем в ВЭЖХ.Теперь сравним скорости потоков, соответствующие минималь­ным значениям ВЭТТ. Для ВЭЖХ она составляет 0,15 см/с, а дляСФХ — 0,6 см/с, т.

е. в 4 раза больше.В отличие от газовой хроматографии, в сверхкритической хро­матографии подвижная фаза не является лишь переносчиком разде­ляемых веществ. Как и в ВЭЖХ, в СФХ могут иметь место физикохимические взаимодействия разделяемых веществ с компонентамиподвижной фазы. Изменение состава подвижной фазы можно ис­пользовать для целенаправленного изменения величин коэффициен­тов селективности а.Глава 5.

Хроматографические и родственные методы »,;is« J ;\ЛВвиду высокой растворимости веществ в сверхкритических фа­зах их определение можно проводить при температурах значительноболее низких, чем температуры испарения. Это открывает широкиевозможности для определения методом СФХ синтетических и био­логических полимеров, а также различных термически нестабиль­ных соединений, для которых неприменим метод газовой хромато­графии. Верхняя граница молекулярных масс определяемых веществзначительно выше, чем в газовой хроматографии и, как и в ВЭЖХ,достигает порядка 105.

Молекулы с еще большей массой (до 107) сле­дует определять методом гель-хроматографии.Применение сверхкритической флюидной хроматографииО больших возможностях использования СФХ для определения не­летучих веществ с достаточно большими молекулярными массамимы уже сказали. К ним относятся многие природные вещества исинтетические материалы, компоненты продуктов питания, нефтей, пестициды, поверхностно-активные вещества, полимеры, взрыв­чатые вещества.Сверхкритическая флюидная хроматограмма смеси олигомеровполиэтилена приведена на рис.

5.43. Обратите внимание, что пикидостаточно узкие несмотря на то, что использована набивная ко­лонка. Характер градиента давления типичен для метода СФХ: вначале процесса — постоянное давление, затем линейное повышениедо максимального значения в течение определенного времени, затемпостоянное максимальное значение до окончания разделения.ЭлектрофорезВ основе методов электрофореза лежит явление миграции ионов,т.е. их движение в электрическом поле.

Коротко об этом явлениибыло сказано в разделе 4.1. Для разделения используют различия ввеличинах подвижностей отдельных ионов.Большинство электрофоретических методов, строго говоря, не­льзя отнести к хроматографии, поскольку здесь не происходит рас­пределения частиц между подвижной и неподвижной фазами. Одна­ко с точки зрения аппаратурного оформления и некоторых теорети­ческих положений как классический вариант электрофореза — набумаге, так и современный — капиллярный — достаточно сходны ссоответствующими разновидностями хроматографии (плоскостнойи капиллярной).5.4- СверхкритическаяОфлюидная10хроматография20время удерживания, мини электрофорез9330Р и с . 5.43.

Анализ смеси олигомеров полиэтилена средней молекулярноймассы 740 при помощи СФХ. Разделяющая колонка: 10 х 0,01 см,набивная, нормально-фазовая, наполнитель — АЬОз, размер зе­рен 5 мкм. Подвижная фаза: CCh, давление 10 МПа в течение7 мин, затем программируемое повышение до 36 МПа в течение25 мин, затем постоянное 36 МПа. Температура колонки 100 0 C.Детектор — пламенно-ионизационный.Различия в скоростях движения в электрическом поле можно ис­пользовать для электрофоретического разделения не только низко­молекулярных ионов, но и коллоидных частиц, макромолекул, виру­сов и даже целых живых клеток.Классический электрофорезКлассический вариант электрофореза до сих пор широко применя­ют при исследованиях в области биохимии и молекулярной биологиидля разделения, выделения и определения белков, полинуклеотидови других биополимеров.

Различают метод простого электрофорезаи электрофореза на носителе.Предложенный А. Тизелиусом (Нобелевская премия, 1948 г.) ме­тод простого электрофореза был первоначально реализован какпроцесс перемещения ионов вблизи границы контакта двух раство­ров — исследуемого и буферного."Растворы заливают в U-образнуютрубку; находящийся сверху буферный раствор во избежание меха­нического перемешивания должен иметь плотность меньшую, чемисследуемый (рис. 5.44). При наложении при помощи платиновыхэлектродов постоянного напряжения ионы различной природы, на­ходящиеся в исследуемом растворе, в силу их различных подвижностей концентрируются в разных зонах вблизи поверхности разде­ла растворов. Эта разновидность метода называется фронтальнымГлава 5.

Хроматографические и родственные методыэлектрофорезом. Фронтальный электрофорез не позволяет достичьполного разделения.электродыфильтровальная бумагакрышка-QэлектродОдиафрагмаисследуемый раствор(в буфере)/./буферные растворыР и с . 5.44. Схемы установок для простого электрофореза (слева) и элек­трофореза на бумажном носителе (справа).Чаще применяют метод электрофореза на носителе. Здесь ионыперемещаются в неподвижном слое носителя — бумаги или геля,например агарового, полимерного или силикагеля. Слой носителяпропитывают раствором инертного электролита. По концам слойносителя контактирует с буферными растворами, в которые погру­жены электроды (рис. 5.44).

Прилагаемое постоянное напряжениесоставляет сотни и тысячи вольт.Исследуемый раствор наносят в виде как можно более узкой по­лоски вблизи одного из концов слоя носителя. В процессе электро­фореза различные ионы исследуемого раствора образуют отдельныезоны. Этот метод называется зонным электрофорезом.Получаемая в результате картинка — распределение разделяе­мых ионов по зонам — носит название электрофореграммы. Еслиионы окрашены, ее можно наблюдать визуально или регистрироватьфотометрически.

На рис. 5.45 приведена классическая электрофореграмма белков сыворотки крови.Дальнейшее развитие методаДля разделения амфолитов, например аминокислот или белков, при­меняют вариант электрофореза, называемый изоэлектрическим фо­кусированием. В этом методе в направлении электрического полясоздают градиент рН при помощи подходящей смеси буферов. Какизвестно из теории кислотно-основных равновесий (раздел 2.2), мо­лекулы амфолитов при значении рН раствора, равном рН изоэлектрической точки, не движутся в электрическом поле. Поэтому в5.J1.

Сверхкритическая флюидная хроматография и электрофорез95условиях градиента рН молекула каждого амфолита при наложе­нии электрического поля перемещается к области с величиной рН,равной рН ее изоэлектрическои точки. Таким образом, различныеамфолиты концентрируются в различных зонах.Изоэлектрическое фокусированиешироко применяют при анализе сме­сей белков. Необходимое условие при­менения метода — наличие устойчи­вого неподвижного градиента рН.

Егосоздают при помощи смесей большо­го числа низкомолекулярных буфер­ных систем с большой буферной ем­костью. Как правило, это амфолитыс различными значениями изоэлектрических точек. Под действием элек­трического поля они фокусируются врасстояниеРис. 5.45. Электрофореграмма определенных зонах и создают там со­белков сыворотки крови, полу­ ответствующие значения рН.ченная при помощи фотометри­Еще один современный вариантческой регистрации.электрофореза называется изотахофорезом (от греческих слов «изос» —равный и «тахос» — скорость). Как следует из названия, в условияхизотахофореза различные частицы движутся в электрическом полес одинаковыми скоростями.Во всех рассмотренных до сих пор электрофоретических мето­дах частицы движутся в постоянном электрическом поле E с раз­личными скоростями Vf.Vi = Ещ,(5.58)где щ — подвижность г-го иона.Ввиду того, что подвижности ионов различны, для обеспеченияравенства скоростей их движенияE\ui = E2U2-— EnUn,(5.59)необходимо, чтобы каждый г-й ион находился под воздействием по­ля соответствующей напряженности Е{.

Например, еслищ > U2 > ... > Un,тоEi < E2 < . . . < I?,96Глава 5. Хроматографические и родственные методыПри этом, если ион движется слишком быстро, то он попада­ет в находящуюся впереди зону с меньшей напряженностью поля и,таким образом, затормаживается. Наоборот, в случае медленногодвижения ион оказывается в зоне с большей напряженностью поляи ускоряется.

В результате ионы каждого сорта концентрируютсяв очень узкой области пространства. Это явление называется дина­мическим обострением границ зон.На практике движение ионов содинаковыми скоростями достига­ют следующим образом. Для изотахофореза используют капилляр(например, тефлоновый) и два бу­ферных раствора с ионами разныхподвижностей. Один конец капил­ляра заполняют ведущим раство­ром, другой — замыкающим рас­твором. Ионы ведущего растворадолжны иметь более высокую по­движность, чем ионы замыкающе­го раствора.

Характеристики

Список файлов книги