Том 2 (1109662), страница 18
Текст из файла (страница 18)
Анализируемый раствор помещают между зонами обоих буферных растворов. При наложении поля все ионы, находящиесяв капилляре, располагаются в порядке убывания их подвижностейи тем самым разделяются.COONH26-аминокапронат как замыкающий ионОN-CH 2 —CH 2 -SO 3морфолинэтансульфонат как ведущий ионВ частности, для разделения иопределения иммуноглобулина методом изотахофореза в качестве ведущего используют раствор морфолинэтансульфоната с рН 9, а в качестве замыкающего — раствор аминокапроата с рН 10,8.
Капиллярный изотахофорез является очень распространенным вариантомэлектрофоретических методов.В целом использование капиллярной техники позволяет преодолеть многие недостатки, присущие классическим методам электрофореза. Главные из них — недостаточные эффективность и воспроизводимость разделения, а также трудности регистрации зон отдельных ионов. В методах простого электрофореза серьезную проблему представляет джоулево тепло, в значительных количествахвыделяющееся в ходе процесса вследствие высоких значений используемого напряжения и малого сопротивления раствора.
Выделение5.4- Сверхкритическая флюидная хроматография и электрофорезтепла приводит к возникновению тепловых конвекционных потоков, перемешивающих раствор электролита и ухудшающих разделение.Капиллярный электрофорезИспользование в электрофорезе технических наработок, применяемых в капиллярной газовой хроматографии, резко расширило возможности метода. Современный вариант электрофореза называюткапиллярным электрофорезом или, по аналогии с ВЭЖХ, высокоэффективным капиллярным электрофорезом.Капиллярная техника принципиально позволяет реализовать всеразновидности электрофоретических методов. Как и в хроматографии (газовой или флюидной), при этом значительно снижаются помехи вследствие диффузионных процессов.
Кроме того, в капиллярном варианте сопротивление раствора намного выше, чем в классическом. Поэтому количество выделяемого джоулевого тепла меньше, а его отвод (термостатирование капилляра) осуществляется намного проще.Steuerung undAuswertungHochspannungsquelleKeuhlungElektrodePuffer- undProbengefaessPuffergefaessР и с . 5.46. Схема устройства для капиллярного электрофореза.АппаратураСхема установки для капиллярного электрофореза приведена на рис.
5.46.Установка состоит из двух резервуаров с буферными растворами,капилляра с системой охлаждения, источника высокого напряжения,устройства ввода пробы, детектора и регистрирующего устройства.Капилляры для электрофореза обычно имеют длину 10-100 сми внутренний диаметр 25-100 мкм. Материалом служит плавленый4—1150Глава 5.
Хроматографические и родственные методы) ф.?,кварц. Используют капилляры как с немодифицированной, так и смодифицированной внутренней поверхностью. Модификацию осуществляют за счет адсорбции или химического связывания. Капилляр заполняют буферным раствором, гелем или раствором полимера.Величина напряжения, налагаемого на платиновые электродыдля создания электрического поля, составляет до 30 кВ.Ввод пробы обычно осуществляется со стороны отрицательнозаряженного электрода (катода) и может производиться под действием силы тяжести. Для этого конец капилляра со стороны катода опускают в сосуд с анализируемым раствором и приподнимают его на некоторое время приблизительно на 10 см над уровнемжидкости в другом сосуде. Пробу можно вводить и под действиемэлектрокинетических сил.
В этом случае конец капилляра погружают в анализируемый раствор и подают короткий импульс (несколько секунд) высокого напряжения (порядка 5кВ). В результатевозникающего электроосмотического потока (см. ниже) в капиллярзасасывается объем раствора (5-50 нл), пропорциональный времени подачи импульса. Разработаны и автоматизированные системыввода пробы, основанные на изложенных выше принципах.Во внутреннем пространстве капилляра, охлаждаемого окружающим воздухом или при помощи термостата, разделяемые ионыдвижутся к противоположному электроду. Как мы уже упоминали, ввиду того, что сечение капилляра очень мало, электрическоесопротивление раствора велико, а количество выделяемого джоулевого тепла незначительно.
Кроме того, тонкий капилляр характеризуется большой величиной отношения внешней поверхности кобъему, что способствует быстрому отводу тепла. Таким образом,в ходе разделения капилляр практически не нагревается, поэтомуконвекционные потоки жидкости и вызванное этим уширение пиков весьма незначительны. В методе капиллярного электрофорезаширина пиков часто соответствует теоретически возможному минимуму, обусловленному лишь молекулярной диффузией, а число теоретических тарелок достигает 500 000 или даже миллиона.Для детектирования можно использовать методы фотометрии(одноволновой УФ-детектор или диодная линейка), флуоресценцииили различные электрохимические методы. Детектор располагается вблизи одного из концов капилляра. Расстояние от детектора допротивоположного конца капилляра называется эффективной длиной капилляра.5-4- Сверхкритическаяфлюидная хроматография и электрофорезЭлектроосмотический поток и его использование дляразделения веществжРазделение веществ в методе капиллярного электрофореза в целомосновано на тех же принципах, что и в классическом варианте.Однако капиллярные методы имеют одну особенность, связаннуюс наличием электроэндоосмотического потока, обычно называемого просто электроосмотическим потоком.
Причина возникновенияэлектроосмотического потока — образование двойного электрического слоя между раствором и внутренней поверхностью капилляра. Немодифицированная внутренняя поверхность кварцевого капилляра содержит множество силанольных групп, которые обладают кислотными свойствами и в щелочных средах диссоциируют сотщеплением протона. При этом внутренняя поверхность электродазаряжается отрицательно и притягивает из раствора положительно заряженные противоионы. В результате жидкость, находящаяся в капилляре, оказывается как бы заключенной в положительнозаряженную с поверхности трубку (рис. 5.47).
Поэтому при наложении напряжения весь объем жидкости, находящейся внутри капилляра, начинает двигаться к отрицательно заряженному электроду(катоду) как единое целое. Это движение и называется электроосмотическим потоком. Его скорость зависит от плотности отрицательного заряда на внутренней поверхности капилляра и, следовательно,от величины рН раствора (причем очень резко). Обычно электроосмотический поток наблюдается лишь при рН > 4. При этом чемвыше рН, тем больше его скорость. Путем соответствующей химической модификации поверхности капилляра электроосмотическийпоток можно уменьшить, подавить или даже повернуть в противоположном направлении.мицеллаРис.
5.47. Электроосмотический поток, возникающий в результате образования двойного электрического слоя между раствором и внутренней поверхностью капилляра.Фронт электроосмотического потока имеет практически плоскую форму (рис. 5.47), что обусловливает равномерность течения100 Глава 5. Хроматографические и родственные методы) м:жидкости вдоль сечения капилляра. Фронт же обычного гидродинамического потока, например, в любом варианте хроматографи,имеет параболическую форму. Ввиду равномерности электроосмотического потока его наличие не приводит к заметному дополнительному уширению пиков.O-додецилсульфатЕсли бы электроосмотического потока не было,то при наложении напряжения все положительно заряженные ионы двигались бы к катоду, а все отрицательно заряженные — к аноду.
Однако электроосмотический поток вызывает дополнительное перемещение к катоду всего объема раствора. Естественно, что при этом положительно заряженныеионы будут по-прежнему двигаться к катоду (причем с большей скоростью). Однако относительнонаправления движения отрицательно заряженныхионов уже нет однозначного ответа.
Если собственная скорость движения иона превышает скоростьэлектроосмотического потока (что бывает редко),то такой ион будет по-прежнему двигаться к аноду, хотя и с меньшей скоростью. В противном жеслучае ион будет медленно перемещаться к катоду.К катоду, вместе с электроосмотическим потоком,перемещаются и все незаряженные частицы. Такимобразом, детектор, установленный вблизи катода,будет регистрировать сначала катионы, затем нейтральные частицы и, наконец, некоторые анионы.Очевидно, что в описанных условиях все незаряженные частицыдвижутся с одной и той же скоростью и поэтому не могут бытьразделены. Однако их электрофоретическое разделение становится возможным, если ввести в раствор поверхностно-активное вещество, образующее мицеллы, например, додецилсульфат натрия.В водных растворах ядро мицеллы гидрофобно и может захватывать нейтральные молекулы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
