Том 2 (1109662), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Молекулы с размерами,превышающими максимальный диаметр пор, не удерживаются иэлюируются первыми, перемещаясь одновременно с подвижной фазой. Молекулы с размерами, меньшими, чем минимальный диаметрпор, свободно проникают в поры и элюируются из колонки в последнюю очередь.Остальные молекулы, имеющие промежуточные размеры, удерживаются в порах частично и в ходе элюирования разделяются нафракции в соответствии со своими размерами и, частично, формой.Их пики выходят из колонки с временами удерживания, промежуточными между двумя рассмотренными крайними случаями.Основной характеристикой удерживания в гель-хроматографии служит известная нам величина — удерживаемый объем, т.е. произведение времени удерживания на объемную скорость потока подвижнойфазы (см. уравнения (5.27) и (5.28)).
Он равен объему элюента VE,пропущенному через колонку до момента выхода пика компонента.76Глава 5. Хроматографическиеи родственныеметодыОбщий объем гель-хроматографической колонки У0бщ равенУобщ = V0 + Vp + Угель.(5.45)Здесь Vo — мертвый объем колонки (объем межзеренного пространства), Fp — суммарный объем пор, Vsejlb — собственный объем твердой фазы (геля). Для неудерживаемых молекул удерживаемый объем равен мертвому объему VQ. ДЛЯ молекул, свободно проникающихв поры геля, удерживаемый объем равен сумме Vb + Vp (рис.
5.37).В общем случае, когда молекула проводит в порах геля некоторую долю К от общего времени нахождения в колонке, удерживаемый объем VE равенVE = V0 + KVP.(5.46)Величину К можно интерпретировать как коэффициент распределения вещества между порами геля и подвижной фазой в межзеренном пространстве колонки. Она может принимать значения от0до1.• Если молекула совершенно не проникает в поры геля и не удерживается неподвижной фазой, К = 0.• Если молекула свободно проникает в поры, K = I.• В промежуточном случае 0 < К < 1.Все сказанное справедливо лишь в том случае, если между молекулами разделяемых веществ и поверхностью геля не наблюдаетсяникаких физико-химических взаимодействий — в первую очередьадсорбционных.
При наличии таких взаимодействий значения К могут превышать единицу. В этом случае пик вещества выходит из колонки при величине VE большей, чем максимально возможное (приотсутствии взаимодействий) значение, равное Vb + Vp (рис. 5.37 (а)).Величину К можно выразить путем простейшего преобразования соотношения (5.46). В соответствии с уравнением (5.1), она равна отношению концентраций вещества в фазах:К = Щ^>Vp= *,см(5.47)Значения коэффициентов распределения можно использовать длясравнительной х а р а к т е р и с т и к и удерживания вещества н а различных носителях.sdfeonts». амкнаап-Л•• 5.3.
Жидкостная хроматографияНеподвижные фазыНаполнителями колонок для гель-хроматографии служат порошкообразные пористые стекла, силикагель, полисахариды или синтетические полимеры. Размер зерен составляет 5-10 мкм.Пористые стекла и силикагели характеризуются большими скоростями диффузии молекул разделяемых веществ и растворителя впоры и высокой механической устойчивостью, в том числе при повышенных температурах. Такими материалами достаточно легконаполнять колонки. Размер пор составляет от 40 до 2500 А. Недостатком таких материалов является высокая вероятность протекания процессов адсорбции. Поэтому их поверхность часто дезактивируют посредством силанизации.Из синтетических полимеров первоначально использовали лишьстирол-дивинилбензольные сополимеры.
Размер пор можно регулировать, изменяя содержание дивинилбензола и тем самым — степень сшивки. Эти материалы гидрофобны, поэтому их использование возможно лишь при условии, что подвижная фаза неполярна.В настоящее время используют и гидрофильные полимеры — вчастности, на основе сульфированного дивинилбензола или полиакриламидных смол.Размеры пор для наиболее распространенных наполнителей приведены в табл. 5.12. Этими размерами определяются границы исключения молекул — значения относительных молекулярных масс(дальтон), выше которых молекулы не удерживаются гелем.Таблица 5.12. Наиболее распространенные наполнители для гель-хроматографии.Средний размер пор, АГраница исключения, дальтонСополимеры стирола и дивинилбензола~ 102700~ 1041 • 104 — 20 • 104~ 106Ь • 106 — 10 • 106Силикагель1250, 2 • 104 — 5 • 1045000, 05 • 105 — 5 • 10510005 • 105 — 20 • 105Как видно из табл.
5.12, при заданном размере пор границы исключения могут варьироваться в достаточно широком диапазоне.Глава 5. Хроматографические и родственные методыСтрого говоря, определяющей величиной здесь является не молекулярная масса, а объем, который занимает сольватированная молекула в растворе. Он называется гидродинамическим объемом.Подвижные фазыВыбор подвижной фазы определяется природой неподвижной фазы.В зависимости от природы фаз методы гель-хроматографии подразделяются на гель-фильтрационную и гель-проникающую хроматографию.В гелъ-филътрационной хроматографии используют гидрофильные гели.
Подвижной фазой служат водные растворы, как правило,буферные, с контролируемым значением рН. Гель-фильтрационнуюхроматографию применяют для разделения водно-растворимых веществ. В гель-проникающей хроматографии неподвижная фаза гидрофобна, а подвижная — неполярна (тетрагидрофуран, хлористыйметилен, толуол и др.). Этот метод применяют для разделения гидрофобных, нерастворимых в воде веществ.ДетекторыДля детектирования могут использоваться детекторы различныхтипов, применяемые в жидкостной хроматографии — рефрактометрические, фотометрические (в УФ- или ИК-области) и др., сигналкоторых пропорционален концентрации растворенного вещества.Специфическим типом детекторов для анализа высокомолекулярных соединений являются проточные вискозиметры.
Они измеряют вязкость протекающего через них элюента. В присутствиивысокомолекулярных веществ вязкость раствора возрастает, что регистрируется на хроматограмме в форме пика.Применение гель-хроматографииОбычно гель-хроматографию применяют для анализа смесей веществс относительными молекулярными массами выше 2000.Гель-фильтрационную хроматографию часто используют для отделения высокомолекулярных природных веществ от низкомолекулярных, в том числе солей. Например, при использовании неподвижных фаз, характеризующихся границами исключения порядка нескольких тысяч дальтон (см.
табл. 5.12), можно отделять белки отаминокислот и низкомолекулярных пептидов.С помощью гель-проникающей хроматографии можно разделятьразличные гомологи и олигомеры гидрофобных органических ве-hstsOiWK*. ),. -iif.,,,5.3. Жидкостная хроматографияществ, например, жирные кислоты с молекулярными массами в области 100-350.
Для этого в качестве неподвижной фазы используютполимерные гели с границами исключения не выше 1000.Обе разновидности гель-хроматографии широко используютсядля определения молекулярных масс и молекулярно-массового распределения природных и синтетических полимеров.Для определения молекулярных масс используют тот факт, чтозависимость между логарифмом удерживаемого объема и логарифмом молекулярной массы в некотором диапазоне является линейной (см. рис. 5.37 (б)). Предварительно колонку калибруют, используя стандартные вещества с известными значениями молекулярныхмасс Мг и близкие по своей природе и свойствам к анализируемым.Измерив для стандартных веществ удерживаемые объемы VE, методом линейного регрессионного анализа находят коэффициенты 6Qи Ъ\ в уравнении калибровкиlgM r =fto-bilgVE.(5.48)В качестве стандартных веществ, растворимых в воде, используют декстраны, полиэтиленгликоль, сульфированные полистиролыи белки. Примерами нерастворимых в воде стандартных веществмогут служить полистирол, политетрагидрофуран и полиизопрен.Принцип определения молекулярной массы по значениям удерживаемых объемов проиллюстрирован на рис.
5.37 (б) и (в).Достоинства гель-хроматографии. В гель-хроматографиивсе возможные значения удерживаемых объемов укладываются вточно определенный интервал между Vo и VQ + Vp. Поэтому данныйметод характеризуется небольшими временами удерживания, определяемыми значениями коэффициента распределения К. Пики нагель-хроматограммах обычно достаточно узкие и хорошо воспроизводимые. Ввиду того, что вещество не претерпевает в ходе хроматографического процесса никаких химических взаимодействий,оно выходит из колонки в неизменном виде и без потерь.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
