Том 2 (1109662), страница 10
Текст из файла (страница 10)
5.25). Представление хроматограммы в виде линий горизонтальных сечений очень удобнодля выбора оптимальной длины волны детектирования.В табл. 5.10 приведены коротковолновые границы прозрачностиразличных растворителей в УФ-области.56Глава 5. Хроматографические и родственные методыВ В Э Ж Х принципиально возможно фотометрическое детектирование и в ИК-области спектра (раздел 3.3.1). Однако посколькув этом диапазоне большинство наиболее распространенных растворителей (вода, метанол и др.) интенсивно поглощает, этот способдетектирования применяют лишь в специальных случаях.4.04.24.44.6время, мин;сР и с .
5.25. Трехмерная хроматограмма пика фенантрена, полученная припомощи детектора — диодной линейки.-5HФлуоресцентные детекторыИспользование флуоресцентного способа (раздел 3.3.3) позволяетповысить чувствительность детектирования приблизительно в 1000раз по сравнению с фотометрическим. В качестве источника возбуждения флуоресценции чаще всего применяют ртутную лампу(в приборах высокого класса — ксеноновую лампу высокого давления). Для выбора длин волн возбуждения и регистрации используют светофильтры.
Возможна и регистрация всего спектра флуоресценции в целом при помощи спектрофлуориметра. Для определения многих природных соединений, лекарственных препаратов идругих физиологически активных веществ можно использовать ихсобственную флуоресценцию. Для детектирования не флуоресцирующих веществ их химическим путем превращают во флуоресцирующие (дериватизация, см.
рис. 5.30).Рефрактометрические детекторыВ основе рефрактометрического детектирования лежит измерениепоказателя преломления подвижной фазы. Этот метод детектирования абсолютно неселективен и потому универсален; он применим ко5.3. Жидкостнаяхроматография57всем веществам. Единственное необходимое условие состоит в том,чтобы показатели преломления чистой подвижной фазы и раствораопределяемого вещества достаточно сильно различались.Для измерения показател я ПрелОМЛеНИЯ ИСПОЛЬЗуЮТпадающий свет/ \к фотоприемникупризму.
Измерение можно^~^^npmf\^^B~™вести как в отраженном, таки в проходящем свете (см.раздел 3.1). На рис. 5.26 изо стальнаябражена схема рефрактоме пластинкатрического детектора, рабо- Р и с 5 2 6 С х е м а у с т р о й с т в а р е ф р а к т о м е .тающего по принципу отра- трического детектора для ВЭЖХ.жения света. В ходе измерений приходится непрерывно изменять угол наблюдения. Луч светадважды проходит через призму и слой элюента, отражаясь от полированной поверхности подложки — массивной стальной пластинки,служащей одновременно и зеркалом, и термостатом.При рефрактометрическом детектировании используют две одинаковые ячейки — измерительную и ячейку сравнения (через которую непрерывно протекает поток чистого элюента).
Поэтому такойдетектор-рефрактометр называют дифференциальным. Чувствительность рефрактометрического детектора ниже, чем фотометрического в УФ-области. Кроме того, его показания чрезвычайно чувствительны к изменениям температуры. В идеале температуру рефрактометрического детектора следовало бы поддерживать в пределах ±0,001°С. Рефрактометрическое детектирование применяютв случаях, когда вещество не поглощает в УФ-области, например,при определении Сахаров.Электрохимические детекторыЭлектрохимическое детектирование можно осуществлять методами вольтамперометрии, амперометрии, кулонометрии и кондуктометрии (глава 4).Кондуктометрическое детектирование — главный метод детектирования в ионной хроматографии (раздел 5.3.2).
Детекторомслужит проточная кондуктометричеекая ячейка, аналогичная описанной в разделе 4.2.Кулонометрическое детектирование применяется в вариантекулонометрического титрования. При этом происходит взаимодействие определяемого вещества с электрохимически генерированнымреагентом, например, галогенид-ионов с электрохимически генери-Глава 5. Хроматографические и родственные методырованными ионами Ag + (раздел 4.5).
Кулонометрическое детектирование в ВЭЖХ применяют редко.Возможно и волътамперометрическое детектирование путемрегистрации вольтамперных зависимостей на подходящем рабочемэлектроде. Для обеспечения непрерывного детектирования в потоке скорость развертки напряжения должна быть существенно выше, чем скорость движения подвижной фазы. Обычно используютскорости развертки порядка 1 В/с. В силу конструктивных ограничений можно применять только стационарные рабочие электроды.При столь высоких скоростях развертки на стационарных электродах возможно детектирование лишь компонентов полностью обратимых окислительно-восстановительных систем.Значительно более распростравспомогательномупоток элюатанены амперометрический метод кэлектродуи электроду из колонкидетектирования при постоянном сравнения ,значении потенциала рабочегоэлектрода (стеклоуглеродного, золотого, платинового) в области тефлонтефлоноваяпредельного диффузионного топрокладкака определяемого вещества.
Дляотвода тока от электрода сраврабочий электроднения служит вспомогательныйэлектрод (рис. 5.27).Р и с . 5.27. Амперометрический деАмперометрическим методом тектор со стеклоугдеродным рабочимможно детектировать все веще электродом.ства, способные окисляться иливосстанавливаться при выбранном потенциале рабочего электрода (раздел 4.4). Для детектирования предпочтительнее использовать ток окисления, поскольку в этом случае следы растворенного кислорода не оказывают мешающего влияния.
Амперометрическим методом можно селективно и с высокой чувствительностью(до 10~12 моль) детектировать многиебиологически активные вещества, например, гормоны стресса адреналин инорадреналин (катехоламин).А мперометрическое детектироНОадреналинвание неприменимо в присутствииповерхностно-активных веществ (белОНки плазмы крови, моющие средства,содержащиеся в сточных водах и т.д.), поскольку они отравляютповерхность рабочего электрода.к*-.'Ш№. UiJ,';..
*s*«r ',Спектроскопические5.5. ЖидкостнаяхроматографиядетекторыПримером спектроскопических детекторов может служить рассмотренный выше фотометрический детектор с диодной линейкой. Для детектирования в ВЭЖХ используют иHO" > "норадреналинДРУ гие спектроскопические меQJjтоды — масс-спектрометрию (дляодновременной идентификации органических веществ), атомно-абсорбционную,атомно-эмиссионнуюспектроскопию.
Вопросы, связанные с особенностями сопряженияхроматографических и спектроскопических методов, будут рассмотрены в разделе 5.5.Распределительная хроматографияРаспределительный вариант жидкостной хроматографии используется чаще, чем адсорбционный, ионообменный или эксклюзионный.Как правило, методом распределительной жидкостной хроматографии определяют незаряженные полярные вещества с молярной массой не более 3000.
В последнее время разработаны методы определения и более высокомолекулярных веществ.Неподвижные фазыВ жидкостной хроматографии неподвижной фазой служит иммобилизованная жидкость или химически модифицированная поверхность носителя {химически закрепленная фаза).ИммобилизованныеЖИДКОСТИВ классическом варианте жидкостной хроматографии работают сжидкой фазой, которая закреплена на поверхности твердого носителя за счет сил физической адсорбции. Основными материалами дляносителей служат силикагелъ (удельная поверхность 10-500 M2Jv) иоксид алюминия (60-200 м 2 /г).
В качестве неподвижной фазы используют полярные жидкости — воду, триэтиленгликоль. Подвижная фаза представляет собой неполярную жидкость, например, гексан или диизопропиловый эфир.Такой вид хроматографии, когда полярность неподвижной фазывыше, чем подвижной, называется нормально-фазовой хроматографией. В противном случае, когда неподвижная фаза достаточно малополярна (например, углеводород), а подвижная — полярна (вода,метанол) — метод называется обращенно-фазовой хроматографией.Глава 5.
Хроматографические и родственные методыПри использовании неподвижной фазы, закрепленной посредством физической адсорбции (нековалентно), возникает опасность еевымывания в ходе хроматографического процесса. При высоких давлениях, используемых в ВЭЖХ, это становится практически неизбежным. Поэтому нековалентно закрепленные неподвижные фазыприменяют только в классическом варианте жидкостной хроматографии низкого давления. Частичное вымывание неподвижной фазыможет происходить и в этом случае, поэтому колонку периодическирегенерируют, «подпитывая» ее новыми порциями неподвижной фазы. Такую подпитку можно осуществлять и непрерывно, непосредственно в ходе хроматографического процесса, если в подвижнуюфазу вводить в небольшой концентрации вещество неподвижной фазы. Однако в этом случае градиентное разделение становится невозможным.Химически закрепленные фазы\VСпособ химического закрепления неподвижной фазы можно применять как в нормально-фазовой, так и в обращенно-фазовой хроматографии.
В настоящее время наиболее распространен обращеннофазовый метод, на долю которого приходится порядка 75% всеххроматографических анализов.Обращенные фазы. Для закрепления обращенных (неполярных) фаз в качестве носителя используют силикагелъ, а также оксид алюминия и ионообменные смолы. В отличие от классическихионообменных материалов с органической матрицей (раздел 2.6),силикагелъ не набухает, т.е. не изменяет своего объема при контакте с водой или другим растворителем.Силикагель используют в виде однородного пористого (объемпор порядка 1, 2 мл/г) порошкообразного материала с размером зерен 3, 5 или 10 мкм.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
