Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком (1102352), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Рис. 1.7) .24Рис.1.7. Иллюстрация к модели расщепления полимеров под действием акустическойкавитации. При схлопывании кавитационного пузырька радиуса R жидкостьустремляется к центру пузырька. Скорость движения жидкости имеет максимальноезначение у поверхности пузырька U=dR/dt и уменьшается с ростом расстояния отповерхности пузырька. Наличие градиента скорости течения жидкости приводит ктому, что скорости течения на противоположных концах полимера различны. Этоприводит к возникновению растягивающего усилия F в полимере, имеющегомаксимальное значение в центре молекулы.
Таким образом, полимер, расположенныйна расстоянии r от центра пузырька и ориентированный параллельно скороститечения жидкости, подвержен действию растягивающего усилия, которое можетпривести к его расщеплениюВ третьей главе диссертации на основе данной модели предложен подход кмоделированию расщепления ДНК под действием акустической кавитации. Важноотметить, что данная модель позволяет описывать расщепление молекулы ДНК врамках основного механизма механохимического расщепления – то есть на основепредположения о понижении активационного барьера реакции за счет действиярастягивающего усилия. Такой подход позволяет описать позиционный эффектрасщепления ДНК ультразвуком (см. Главу 2), то есть зависимость скоростирасщепления фосфодиэфирной связи от ее положения в цепи молекулы [Il‟icheva et al,251999]. Экспериментальные профили расщепления ДНК под действием ультразвукадемонстрируют значительное увеличение скорости расщепления фрагмента ДНК вцентральной части молекулы, что свидетельствует в пользу выбранной моделирасщепления, согласно которой сила растяжения имеет максимальное значение вцентре фрагмента.Следует отметить, что наблюдаемое расщепление ДНК под действиемультразвука высокой интенсивности также может быть связано с действием ударныхволн, образующихся при схлопывании кавитационных пузырьков.
В случае действияударной волны импульсная механическая деформация молекулы может происходитьиз-за резкого изменения давления растворителя. Была предложена модель расщепленияполимеров под действием ударных волн кавитации [Gooberman, 1960], позволяющаяописать позиционный эффект расщепления, наблюдаемый в экспериментах поультразвуковойдеградациимакромолекулполистирола.Однако,возможностьприменения данной модели для описания расщепления коротких фрагментов ДНК –длиной от нескольких десятков до нескольких сотен нуклеотидных пар – требуетдополнительного исследования.В данной работе рассмотрена традиционная модель расщепления, описывающаяразрыв ДНК как результат взаимодействия молекулы с высокоградиентным течениемжидкости,возникающимвблизисхлопывающегосякавитационногопузырька.Возможность расщепления ДНК под действием ударных волн кавитации требуетдополнительных как экспериментальных, так и теоретических исследований.26Глава 2.
Ультразвуковое расщепление ДНК: обработка и анализэкспериментальных данныхВ данной главе описана экспериментальная процедура расщепления ДНКультразвуком, методика получения и обработки данных. Приведены характерныесвойства наблюдаемого расщепления, а также результаты статистического анализаспецифичности ультразвукового расщепления ДНК.2.1. Описание эксперимента и процедуры обработки экспериментальных данных.Фрагменты ДНК получали расщеплением λ - фага и плазмид pBR322, pUC18 иpGEM7(f+)(Promega),содержавшихвполилинкерахразличныевставки,соответствующими рестриктазами.
Для введения радиоактивной метки в 3'-конецфрагментов использовали [-33P]dATP или [ -33P]dCTP (“ФГУП” Институтреакторных материалов, Заречный, Свердловская обл.), остальные немеченые dNTP ифрагмент Кленова ДНК-полимеразы I Escherichia coli (Boehringer Mannheim, Германия).Выделение фрагментов ДНК проводили в 5%-ном полиакриламидном геле толщиной1мм, с последующей элюцией и осаждением. Последовательности фрагментов и другиематериалы, касающиеся эксперимента, приведены на сайте http://grok.imb.ac.ru\enОблучение растворов фрагментов ДНК ультразвукомДля приготовления образцов 10 мкл раствора фрагмента ДНК (примерно 104 Бк)в воде смешивались с 10 мкл 0.2 М NaOAc, рН 6.0 в тонкостенных полипропиленовыхпробирках на 0.2 мл (N801-0540, Perkin-Elmer, USA).
Конечная концентрацияфрагмента составляла 5 - 10 мкг/мл или ~10 мкМ п.н.Облучение проводилось на ультразвуковом диспергаторе УЗДН-2Т (Украина)при частоте 22 кГц. Фотография и схема установки приведена на Рис.2.1. Пробиркипомещали в тефлоновое кольцо с центральным отверстием 15 мм и с радиальнымиотверстиями для пробирок так, чтобы концы пробирок, в которых находилисьтестируемые растворы, находились на расстоянии около 0.5 см от поверхности торцаизлучателя, диаметр которого составлял 12 мм.
Кольцо и излучатель помещались вбаню с водой и мелкоразмолотым льдом, которая вращалась со скоростью два оборотав минуту. Мощность ультразвука определялась калориметрически и составила более 70Ватт.27Рис.2.1. Схема установки для облучения фрагментов ДНК ультразвукомДля контроля кавитации использовалась тестовая пробирка, содержащая 20 мкл0.05M KJ в 0.025%-ном растворе крахмала.
После облучения в течении 8 мин степеньокрашивания раствора была эквивалентна добавлению примерно 10-4 M перекисиводорода. Для контроля меньших доз экспозиции использовался аналогичный тест,содержащий раствор крахмала, насыщенный CCl4 при 20oС. Следует отметить, чтонаблюдаемый выход перекиси водорода соответствует известным из литературырезультатам, полученным при нормальной температуре и интенсивности ультразвука 2Ватт/см2 [Маргулис, 1984]. Известно, что низкая частота ультразвука и низкаятемпература раствора приводят к усилению кавитационных эффектов [Basedow et al,1977]Разделение фрагментов в денатурирующем гелеПосле облучения к смеси добавляли 90 мкл раствора 0.15 М NaCl, 50 мM ТрисHCl (рН 7.5), 10 мМ EDTA, 10 мкг/мл тРНК.
Смесь экстрагировали фенолом, ДНКосаждали этанолом, промывали 70%-ным этанолом, высушивали, растворяли в 1 мкл95%-ного формамида, содержащего 15 мМ EDTA (pH 8.0), 0.05% бромфенолового28синего и 0.05% ксиленцианола FF, нагревали 1 мин при 90oC, быстро охлаждали до 0oСи наносили на денатурирующий ПААГ длиной 40 см с градиентной толщиной 0.15-0.45мм. Электрофорез проводили 55 мин при 100 Вт (2.5 кВ) при температуре 60-70oC.Перед экспонированием гель фиксировали в 10%-ной уксусной кислоте и высушивалина стекле, предварительно обработанном гамма-метакрилпропилоксисиланом (LKB,Швеция) и экспонировали с люминесцентным экраном с последующим сканированиемна приборе “Cyclone Storage Phosphor System” (Packard BioScience Company, USA).Анализ гелейДляанализаиспользоваласьгелей,типичнаякомпьютернаякартинапрограммакоторыхSAFA,показанаразработаннаянаРис.2.1,группойизСтендфорского университета [Das et al, 2005].
Эта программа позволяет послекорректировки треков дорожек геля вычислять интенсивности всех полос на всехдорожках, и соотносить эти полосы с заданной последовательностью нуклеотидов припомощи дорожки, содержащей результаты химического расщепления известнойпоследовательности по пуринам. Анализ ряда полученных гелей, проведѐнный спомощью программы OptiQuant (Packard Instrument Company), показывал сходныерезультаты.Значениеинтенсивностикаждойполосынагелепропорциональноконцентрации фрагмента ДНК определенной длины и, поэтому,соответствуетскорости расщепления определенной фосфодиэфирной связи начального фрагмента.Степень расщепления ДНК – то есть доля расщепленных фрагментов - повышается приувеличении времени облучения фрагмента ультразвуком.
Также следует отметитьнаблюдаемый эффект увеличения скорости расщепления фрагментов ДНК в ихцентральной части – так называемый позиционный эффект.На абсолютную величину интенсивности полосы на геле влияет множествофакторов, которые могут меняться от эксперимента к эксперименту, поэтому, прианализе экспериментальных данных следует оперировать относительными значениямиинтенсивностей полос, а не абсолютными значениями.В дальнейшем, абсолютная величина интенсивности полосы на гелебудетназываться интенсивностью расщепления I, а относительная велична – относительнойчастотой расщепления R.Для вычисления относительных частот расщепления, значение интенсивностикаждой полосы делилось на среднее значение интенсивностей определенногоколичества соседних полос:29Rn (2m 1)InnmIk nm,kгде n, k – номера полос, m – параметр, характеризующий величину «окна», по которомупроводится усреднение.
Варьирование величины такого «окна» показало, чтооптимальным является величина в 31 нуклеотид (т.е. в 31 полосу) - уменьшение этойвеличины приводит к увеличению разброса данных, а дальнейшее увеличениепрактически не сказывается на соотношении полученных значений, но приводит куменьшению числа анализируемых значений на величину «окна» для каждого геля.Эта операция в дальнейшем будет называться процедурой нормализацией данныхрасщепления.
Описанная процедура нивелирует эффекты уменьшения интенсивностирасщепления к концам фрагмента и различия в интенсивностях дорожек на разныхгеляхи,поэтому,используетсядлястатистическогоанализавлиянияпоследовательности пар оснований на скорость ультразвукового расщепления ДНК.2.2. Характерные свойства ультразвукового расщепления ДНКДля того чтобы продемонстрировать характерные картины ультразвуковогорасщепления, полученные при помощи электрофореза в полиакриламидном геле, далееприведен Рис.2.2, представляющий изображение геля, полученного в результатеультразвукового облучения фрагментов ДНК различной длины.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
