Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком (1102352), страница 10

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 10)

Показано, что частотарасщепления фосфодиэфирных связей противоположной цепи ДНК, находящихсянапротив разрыва, увеличивается в 10-30 раз, в зависимости от места расположенияника (то есть начального разрыва) в фрагменте [Il‟icheva et al, 2009]. Наличие разрыва водной из цепей ДНК приводит к тому, что большая часть нагрузки, связанной с59действием силы растяжения, переносится неразорванную цепь сахарофосфатногоостова, что можно приближенно описать следующим образом:γn = 2 γ0,(3.11)где γn и γ0 – трансмиссионные коэффициенты в случае наличия разрыва впротивоположной цепи и при его отсутствии, соответственно.Отношение теоретических констант скоростей разрыва k, рассчитанных на основанииуравнения (3.10), для значений γn и γ0, и полученных при γ0=0.2 , γ0=0.3 и γ0=0.4, равнысоответственно: 16; 7 и 6, то есть находятся в качественном согласии сэкспериментальными данными, приведенными выше.Уравнение (3.10) может быть модифицировано с целью нахождения теоретическогопрофиля ультразвукового расщепления, то есть зависимости вероятности расщепленияфрагмента ДНК по данной фосфодиэфирной связи от положения этой связи в цепиполимера: 4r n  k e20k i отн Fi ( G ( r ,t ))kT0dtdrt ,r(3.12), 4r n dr20rгде i –номер звена модельной системы, в котором происходит расщеплениефосфодиэфирной связи, а Fi – сила растяжения этого звена.

Показано, что отношениесилы растяжения центрального звена модельной системы к силе растяжения i-ого звенапрактически не зависит от величины градиента скорости течения жидкости (данные неприводятся), поэтому для описания позиционной зависимости силы растяжениядостаточно ввести функцию α(i):Fi =Fmax. α(i),(3.13)где Fmax – сила растяжения центрального звена модельной системы, то есть α(i) ≤ 1.На рисунке 3.10 представлены результаты расчета относительных скоростей реакциигидролиза на основании уравнения (3.11), в котором ориентационный фактор β такжепринят равным единицы, а γ =0.4 .60Рис.3.10. Сравнение теоретического профиля относительных скоростей разрывазвеньев модельной системы с экспериментальным профилем расщепления ДНКультразвуком.Как видно из рисунка, полученные теоретические результаты позволяют качественноописать позиционный эффект, наблюдаемый при анализе картин расщепления ДНКультразвуком.3.4.

ОбсуждениеПолученные результаты свидетельствуют о применимости модели Томаса кописанию ультразвукового расщепления фрагментов ДНК длиной от несколькихдесятков до сотен нуклеотидных пар. Предложенный подход к описанию процессарасщепления основывается на этой модели и объединяет:1. гидродинамическую модель динамики кавитационного пузырька;2.механическуюмодель,описывающуювзаимодействиефрагментаДНКсвысокоградиентным течением жидкости, возникающим в процессе схлопываниякавитационного пузырька;3. статистическую модель кинетики процесса расщепления фосфодиэфирных связейфрагмента ДНК под действием возникающих сил растяжения.Полученные результаты демонстрируют возможность расщепления ДНК вблизикавитационного пузырька уже на промежуточной стадии схлопывания, при которойвеличина градиента скорости течения жидкости может составлять величину порядка61108 c-1, а растягивающие молекулу усилия, возникающие при ее взаимодействии сокружающей жидкостью, - порядка нескольких тысяч пиконьютонов.

Особенностьраспределения растягивающего усилия вдоль полимера также позволяет описатьнаблюдаемыйэффектпозиционнойзависимостивероятностирасщепленияфосфодиэфирных связей ДНК от их положения вдоль цепи.Полученные результаты носят качественный характер в силу ряда факторов,усложняющих более точное описание наблюдаемого процесса расщепления ДНК поддействием ультразвука. Предложенные модели опираются на приближение сильноразбавленного раствора ДНК, которое не вполне правомерно: концентрация ДНК,имеющая место в эксперименте, составляет величину 5 - 10 мкг/мл, а наличие вбуферном растворе различных компонентов (например, Na+) может приводить кизменению большинства параметров, используемых при расчетах.Принятое при моделировании значение интенсивности ультразвуковой волныI=2 Ватт/см2 может быть завышенным, так как было определено косвенным образом –при помощи сравнения с экспериментальными данными по выходу перекиси водорода,полученным при более высокой температуре.

Тем не менее, представленныерезультаты моделирования предлагают скорее нижний предел значений градиентовскорости течения жидкости, так как не учитывают ряд факторов, приводящих кувеличению скорости схлопывания пузырька, не говоря уже о наличии третьей стадиисхлопывания, которая в предложенной модели не рассматривалась. Также остается«открытым» вопрос о конформации полимера при наличии значительной силырастяжения, действующей на временных масштабах порядка нескольких наносекунд.Значение константы жесткости k=6000 пкН, принятое в механическое моделипостоянным, зависит от силы растяжения ДНК, что в свою очередь влияет на динамикуее растяжения.

Стоит также отметить, что полученные времена релаксации полимера кстационарному состоянию растяжения при его движении в жидкости с высокимзначением продольного градиента скорости течения, составляли величину порядканескольких наносекунд (данные не приведены).Таким образом, использованиеравновесных значений сил растяжения F(G) в уравнении (3.10) как функций градиентаскорости течения G, также являетсяприближением, приводящим к завышению62значений растягивающих усилий. Растягивающие усилия F также существеннымобразом зависят от вязкости окружающей полимер жидкости и гидродинамическогорадиуса звена модельной системы – параметров, значения которых известны лишьприближено. Все эти величины, включая трансмиссионный множитель γ, влияют назначение силы растяжения f, действующей на уровне ковалентной связи и являющейсяопределяющей для кинетики процесса расщепления в силу экспоненциальнойзависимости скорости расщепления от величины f.

Таким образом, изменяя величинуγ, можно моделировать влияние на теоретическую скорость расщепления ДНК такихпараметров как вязкость жидкости, гидродинамический радиус сегмента цепи, длинафрагмента и его жесткость. Также стоит отметить, что предположение о гидролизеДНК в качестве основного механизма разрыва цепи полимера по действиемрастягивающего усилия может быть дополнено рассмотрением реакции прямойдиссоциации ковалентной связи под действием экстремально больших значенийрастягивающих усилий, по всей видимости, имеющих место на конечной стадиисхлопывания кавитационного пузырька, а также в случае расщепления под действиемударных волн кавитации.Следуетотметить,чтосравнениерезультатовмоделированиясэкспериментальными данными по скорости расщепления ДНК, приведенное вышеносит условный характер, так как концентрация зародышей кавитации в описанныхэкспериментах неизвестна.

Этот параметр может принимать значения от единиц досотен тысяч зародышей на миллилитр раствора [Arora et al, 2007], и существеннымобразом зависит от его физико-химических свойств. Полученная оценка концентрациизародышей - 103 мл-1, при которой теоретические значения скорости расщепления ДНК(γ=0.4) качественно соответствуют экспериментальным данным, – также существеннымобразом зависит от величины транмиссионного коэффициента γ. При γ=0.2 оценкаконцентрации зародышей кавитации приводит к величине порядка 10 4 мл-1. Такимобразом,полученныеоценкисоответствуютдостаточновысокимзначениямконцентрации зародышей кавитации.

Важно отметить, что имеются данные,свидетельствующие о том, что присутствие молекул ДНК может приводить кувеличению концентрации зародышей кавитации в растворе [Lentz et al, 2005].63Глава 4. Подходы к интерпретации специфичности расщепления ДНКультразвукомСреди особенностей наблюдаемого расщепления ДНК ультразвуком можно выделитьдве основные черты – это наличие позиционной зависимости частоты расщепления испецифичностьрасщеплениякнуклеотиднойпоследовательностиоблучаемыхфрагментов. Данная глава посвящена исследованию обнаруженной специфичностиультразвукового расщепления ДНК, а также построению модели, предлагающейинтерпретацию этого явления.4.1.

Особенности конформационной динамики B- формы ДНККакужебылоотмеченоранее,существуетмножествофизико-химическиххарактеристик ДНК, зависящих от последовательности нуклеотидов в молекуле.Основная задача данного раздела – выявление таких структурных свойств ДНК,которые в наибольшей степени согласуются со статистическими данными поспецифичности расщепления ДНК ультразвуком.Одной из наиболее успешных и активно используемых параметризацийконтекстно-зависимыхсвойствДНКявляетсяописаниетермодинамическихпараметров ДНК в рамках модели ближайших соседей – то есть на уровнединуклеотидного приближения. Стоит отметить, что параметры свободной энергииобразования дуплекса ДНК, характеризующие термодинамику плавления двойнойспирали молекулы, не согласуются с полученным данными по ультразвуковомурасщеплению ДНК – так, например, динуклеотиды d(CpG) и d(GpC) характеризуютсяпрактически одинаковыми значениями свободных энергий образования дуплекса, в товремя как относительные частоты их ультразвукового расщепления отличаются болеечем в 1.5 раза.Также известно, что образование необычных структур в ДНК, таких как кинки(изломы) и пузыри (локальное раскрытие дуплекса), наиболее часто происходит в A-Tбогатых участках молекулы.

Характеристики

Список файлов диссертации