Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком (1102352), страница 11

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 11)

Тем не менее, частота ультразвукового расщепления ДНКв таких областях значимо не отличается от среднего уровня расщепления.64Как было показано в Главе 3, по всей видимости, существенную роль в процессерасщепления ДНК под действием акустической кавитации играет распределениерастягивающегоусилия по степеням свободы молекулы: в зависимости отконформации и динамических особенностей сахарофосфатного остова, растягивающееусилие может по-разному передаваться на фосфодиэфирную связь, приводя кувеличению, или наоборот – уменьшению вероятности ее расщепления. Таким образом,в процессе расщепления ДНК под действием ультразвука могут проявлятьсяконформационно-динамические особенности сахарофосфатного остова ДНК.В B-форме ДНК существует ряд локальных конформационных движений,динамика которых определяется нуклеотидным составом молекулы, а также физикохимическими параметрами растворителя.

Наиболее изученными среди них является S↔ N интерконверсия дезоксирибозы [Isaacs et al, 2001], а также BI↔BII переходысахарофосфатного остова [Heddi et al, 2006].Интерконверсия сахарного цикла связана с транс↔гош+ вариациями угла δ (см.Рис.4.1), влияющего на ориентацию фосфодиэфирной связи С3‟-O3‟, а также свращением цикла по отношению к гликозидной связи (изменение угла χ).Рис.4.1. Фрагмент сахарофосфатного остова B-формы ДНК с обозначениями угловвнутреннего вращения.65Как уже было отмечено, одним из основных результатов статистическогоанализа специфичности ультразвукового расщепления ДНК является значимоеувеличение относительной частоты расщепления фосфодиэфирной связи, следующейза дезоксицитидином, то есть связи, соединяющей сахарный цикл, примыкающий кцитозину, с фосфатной группой следующего по цепи нуклеотида (см.

Рис.2.4 и таблицу1). Так как на Рис.4.1. приведены два подряд идущих дезоксицитидина, то сказанноевыше относится к обеим связям С3‟-O3‟, изображенным на рисунке.Таким образом, можно предположить, что некоторое структурное свойствоучастка, соединяющего дезоксицитидин со следующим по цепи нуклеотидом, должноиметь особенность, отличающую это сочленение от похожих сайтов, образованныхдругими типами нуклеотидов. Это предположение подтверждается как теоретическими,так и экспериментальными данными.Квантово-химические расчеты Ab initio демонстрируют уникальные свойствадезоксицитидина [Foloppe et al, 1999]: область минимальной потенциальной энергиикак при S, так и при N конформации дезоксирибозы соответствует углам χ,относящимся к A-форме ДНК.

Более того, конформация, соответствующая N-типудезоксирибозы в дезоксицитидине обладают меньшей энергией, чем для S-типасахарного цикла, который свойственен B-форме ДНК [Foloppe et al, 1999]. Такимобразом, конформационные предпочтения дезоксицитидина не вполне соответствуютB-формеДНК,чтоможетприводитькконформационнымпереходамегодезоксирибозы. В действительности, эти переходы были обнаружены при помощиЯМР-методов и молекулярно-динамических расчетов: показано, что дезоксирибоза,примыкающая к цитозину, подвержена S↔N интерконверсии в значительно большейстепени, чем дезоксирибозы других нуклеотидов [Duchardt et al, 2008; Wu et al, 2003].Другой тип конформационных движений в B-ДНК – так называемый BI↔BIIпереход – определяется согласованным изменением углов ε и ζ (см.

Рис. 4.1) иподразумевает переход от канонического состояния BI (соответственно транс и гош–конформация углов ε и ζ ) к состоянию BII (значения углов- гош–и транс).Вероятность переходов, а также заселенность конформационных состояний такжезависит от локального нуклеотидного состава ДНК. Существующая статистика по66равновеснымдолямконформеровВI/BIIдляразличныхнуклеотидныхпоследовательностей [Heddi et al, 2010] не находит значимой корреляции с величинамиотносительныхчастотультразвуковогорасщепленияДНК.Высокийпроцентконформеров BII типа в динуклеотидах d(СpG) и d(CpA), имеющих высокий уровеньультразвукового расщепления, также имеет место в динуклеотидах d(TpG), d(GpG),d(GpC) и d(GpA), со значительно меньшими значениями относительных частотультразвукового расщепления. Более того, относительная частота расщепления вдинуклеотиде d(CpT) высока, в то время как для этого динуклеотида BII состояний небыло обнаружено.

Таким образом, склонность к BI↔BII переходам для определенногосайта ДНК, по всей видимости, не оказывает значимого влияния на вероятностьультразвукового расщепления фосфодиэфирной связи в этой области.Подводяособенностьюитогданному разделу,конформационнойможнодинамикизаключить,B-ДНК,чтокотораяединственнойсогласуетсясполученными данными по специфичности ультразвукового расщепления, являетсяS↔N интерконверсия дезоксирибозы, примыкающей к цитозину.

В следующем разделена основе данного заключения построена модель, при помощи которой даетсяинтерпретация специфичности расщепления ДНК под действием ультразвука высокойинтенсивности.4.2. Влияние конформационной подвижности дезоксирибозы на эффективностьультразвукового расщепления ДНК.Как уже было отмечено, при S↔N интерконверсии дезоксирибозы происходитпереориентация С3‟-O3‟ связи. Для более детального анализа особенностей Nконформации дезоксирибозы были исследованы кристаллографические структурысвободныхолигонуклеотидовДНК,содержащихС3‟-эндоконформациюдезоксирибозы (то есть минорную – N-конформацию). Были рассмотрены структуры скодовыми именами 1fq2, 1jgr, 2fih и 355d, приведенные в структурной базе данных67нуклеиновых кислот http://www.ndbserver.rutgers.edu/, причем в каждой из структурсодержалось несколько С3‟-ендо конформаций дизоксирибозы.Анализ кристаллографических структур олигонуклеотидов ДНК, содержащихN–конформацию дезоксирибозы показал, что в С3‟ эндо конформации (то есть вминорной, N-конформации), уменьшается угол между осью спирали и направлениемС3‟-O3‟ связи, как показано на Рис.

4.2.Рис.4.2. Расположение фосфодиэфирной связи по отношению к оси спирали ДНК вслучае C2’ эндо и С3’ эндо конформации дезоксирибозы. С3’ эндо конформацияизображена менее ярко. Ось z – ось двойной спирали ДНК.Для N конформации получено следующее значение среднего угла между осьюспирали z и направлением С3‟-O3‟ связи: αN =64o ± 3 o , а для S-конформации (то естьС2‟ – эндо конформации сахарного цикла, свойственной B-форме ДНК): αS =81 o ± 5 o.Как было отмечено в Главе 3, значение трансмиссионного коэффициента γ,характеризующегодолюрастягивающегоусилияf,приходящегосянафосфодиэфирную связь, по отношению к величине суммарного натяжения F, зависитот распределения последнего по степеням свободы молекулы. Предположим, что68данная цепь сахарофосфатного остова имеет некоторое натяжение Fо , сонаправленноес осью спирали (см Рис.4.2.), то есть направленное вертикально.

Рассмотримраспределение сил, действующих на атом O3‟ в рамках молекулярно-динамическоймодели, включающей вибрационную энергетическую компоненту ( то есть энергию,связанную с деформацией валентной связи) и энергию, связанную с деформациейвалентных углов. Энергетическая составляющая, связанная с деформацией угловвнутреннего вращения, а также с невалентными взаимодействиями, не рассматриваетсяв силу малости значений сил, вызываемых такого рода взаимодействиями поcравнению с силами растяжения, приводящими к разрыву молекулы.

Проекция силырастяжения остова на направление связи, действующая со стороны нижней частимолекулы на атом O3‟(cм. Рис.4.2) может быть связана только с деформациейвалентной связи С3‟-O3‟, так как силы, действующие на атом O3‟, связанные сдеформацией валентных углов, образованных атомами X - С3‟- O3‟ (X-любой атом),очевидно, направлены перпендикулярно к направлению валентной связи С3‟-O3‟.Поэтому, для силы растяжения f, действующей на уровне фосфодиэфирной связи С3‟O3‟ можно записать простое соотношение:f=F0 cos(α)(4.1),где α – угол между направлением действия силы Fo и направлением связи.

Чем меньшеугол между связью С3‟-O3‟ и осью спирали, тем большую величину составляет сила f,и, следовательно, тем выше вероятность гидролиза этой связи. Таким образом, длятрансмиссионных коэффициентов в случае различных конформационных состояний Nи S дезоксирибозы , можно записать:γN = γ0 cos(αN),γS = γ0 cos(αS)(4.2),где коэффициент γ0 описывает долю нагрузки, приходящейся на данную цепь остова.Указанные в литературепроцентные доли N – конформации дезоксирибозыдезоксицитидина в динуклеотиде d(CpG) составляют величину около 30 % [Wu et al,2003].69Предположим, что при наличии растягивающего усилия, дезоксирибоза,примыкающая к цитозину, остается в том же состоянии, что и до него. В таком случаедля полной скорости механохимической реакции гидролиза фосфодиэфирной связи вдинуклеотиде d(CpG) можно записать:kCG = PS kS + PN kN(4.3),где kCG – полная скорость механохимической реакции гидролиза по фосфодиэфирнойсвязи, примыкающей к дезоксицитидину, PS - вероятность пребывания дезоксирибозыдезоксицитидина в S – состоянии, kS – скорость реакции гидролиза фосфодиэфирнойсвязи, примыкающей к дезоксирибозе в S конформации, а PN и kN - аналогичныевероятность и скорость гидролиза для N состояния, соответственно.

В соответствии суказанным выше предположением, PS = 0.7; PN = 0.3.Для скорости гидролиза центральной фосфодиэфирной связи в динуклеотиде d(ApA)можем по аналогии записать:kAA = kS(4.4),так как для дезоксирибозы аденина N-конформации не было обнаружено. Используяэкспериментальное соотношение kCG ≈ 1.6 kAA, полученное из Таблицы 1 Главы 2, атакже (4.3) и (4.4), получаем: kN ≈ 3 kSC другой стороны, в соответствии с уравнением (3.10) и (4.2) для величин kN и kS можнозаписать: 4r n  k e20kN  0 cos( N ) F ( G ( r ,t ))kT0dtdrt ,r 4r n dr20r 4r n  k e20kS (4.5) 0 cos( S ) F ( G ( r ,t ))kT0t ,r 4r n dr20r70dtdrВычисление величин kN и kS на основе уравнения (4.5) при различных значенияхпараметра γ0 и значений углов, соответствующих кристаллографическим данным, даетвеличину отношения kN / kS> 10.

Естественно предположить, что при высокихзначениях растягивающего усилия, угол между осью спирали и направлением связибудет уменьшаться – в том числе и для S-конформации дезоксирибозы, - что можетуменьшить теоретическое значение отношения kN / kS .Также неясен вопрос о возможности конформационных переходов сахарногоцикла, индуцированных действием растягивающего усилия – то есть правомерностьиспользования для величин PN и PS значений, соответствующих экспериментальнымданным, полученным при отсутствии действия внешней силы. Тем не менее,полученные результаты позволяют заключить, что предложенная модель качественноописывает эффект увеличения вероятности расщепления фосфодиэфирной связи приувеличении конформационной подвижности примыкающей к ней дезоксирибозы.Далее кратко подведены итоги раздела.Вданномразделеописанамодель,предлагающаяинтерпретациюспецифичности ультразвукового расщепления ДНК и основанная на результатах Главы3 и раздела 4.1.

Основная идея предложенной модели заключается в том, что приналичии растягивающего усилия, направленного вдоль фрагмента ДНК, уменьшениеугла между направлением химической связи и осью спирали приводит к увеличениюэнергии деформации этой связи. В свою очередь, это приводит к уменьшениюэнергетическогобарьерагидролиза,азначит,кувеличениюскоростимеханохимической реакции, приводящей к расщеплению фрагмента ДНК. Такимобразом,приувеличенииконформационнойподвижностидезоксирибозыувеличивается время пребывания сахарного цикла в N конформации, при которойвероятность осуществления механохимической реакции выше, а значит относительнаячастота расщепления увеличивается.714.3.

Характеристики

Список файлов диссертации