Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком (1102352), страница 3
Текст из файла (страница 3)
При описании структуры ДНК достаточночасто применяется приближение жестких пар оснований – в таком случае, локальнаяконформация ДНК определяется шестью параметрами – тремя угловыми и тремятрансляционными, которые характеризуют относительное расположение двух подрядидущих пар оснований (см. Рис. 1.2).Рис.1.2.
Конформационные параметры ДНК, используемые при анализе структурныхсвойств ДНК в приближении жестких пар оснований.Элементарнымзвеномдляанализавтакомприближенииявляетсядинуклеотидный блок. Учитывая симметрию ДНК, возможны 10 различных типовдинуклеотидных блоков:AA (TT), AC (GT), AG (CT), AT, CA (TG), CC (GG), CG, GA (TC), GC, TA,В скобках указаны комплементарные динуклеотиды в противоположной цепиДНК, то есть в данном случае блок AA и блок ТТ в виду симметрии представляют одини тот же динуклеотидный блок двойной спирали ДНК.Анализируя данные о конформации различных олигонуклеотидов, для каждогодинуклеотидного блока находят средние значения структурных параметров, а такжезначения констант жесткости, которые в гармоническом приближении описываютэнергетические аспекты деформации динуклеотидного блока [Fujii et al, 2007; Olson etal, 1998]. Полученные значения используют для вычисления энергетических иэнтропийных барьеров деформации ДНК в комплексах с различными белками с целью12описания наблюдаемой специфичности связывания [Becker et al, 2006].
В работе[Koudelka, 1998] показано, например, что константа связывания белка-репрессора соператорным участком значимо коррелирует с величиной торсионной подвижностицентральныхдинуклеотидныхблоков(тоестьсвеличиной,обратнопропорциональной жесткости по отношению к изменению угла относительногоповорота пар оснований (см. Рис. 1.2.)) а также cо значениями углов поворота (twist) вданном сайте для свободной ДНК.Исследование зависимости конформационно-динамичеcких параметров ДНК (тоесть параметров, характеризующих как равновесную локальную конформацию ДНК,так и способность к ее изменению) от последовательностей пар оснований, какправило, проводят в рамках ди- и тетрануклеотидных приближений. Показано, что типближайшихпоцепинуклеотидовоказываетсущественноевлияниенаконформационную динамику динуклеотидных блоков ДНК [Dixit et al, 2005; Fujii et al,2007].Стоитотметить,чторезультаты,полученныеразличнымиметодамиисследования структурных свойств, далеко не всегда согласуются количественно, чтоприводит к дополнительным сложностям.
Тем не менее, существует общаязакономерность, выявленная при анализе структурных свойств ДНК различнымиметодами на динуклеотидном уровне описания, которая может быть описанаследующим образом: D (PyPu) > D (PuPu) > D (PuPy),где под D понимается общая подвижность динуклеотидного блока (величина,пропорциональная объему конформационного пространства), Py – пиримидин, то естьнуклеотид C или T, а Pu – пурин – то есть нуклеотид А или G [Fujii et al, 2007].Последовательность PyPu отвечает динуклеотидному блоку ДНК, в котором внаправлении от 5‟ к 3‟ концу цепи за пиримидином следует пурин.Важно отметить, что существующих данных рентгеноструктурного анализа иЯМР не достаточно для исследования эффектов последовательности ДНК наконформационную динамику на тетрануклеотидном уровне, поэтому для этой цели, какправило, используются результаты компьютерного моделирования [Dixit et al, 2005;Fujii et al, 2007; Packer et al, 2000].Во многих случаях связывания белка с ДНК имеет место сильный изгибмолекулы ДНК.
На рисунке 1.3 приведена структура комплекса ДНК с ТАТА –связывающим белком ( TATA-binding protein, TBP ). TBP специфически «узнает»13TATA- участок ДНК в промоторе и входит в состав белкового комплекса,инициирующего транскрипцию.Рис.1.3. Структура комплекса ДНК с TATA – связывающим белком, полученнаяметодами рентгеноструктурного анализа. Фиолетовым цветом изображен белок, аостальными цветами – молекула ДНК (PDB code: 1cdw).Связывание TBP с ДНК приводит к изгибу оси двойной спирали на угол,составляющий около 80о. Cчитается, что конформационные изменения, происходящиев ДНК в результате образования данного комплекса, в конечном итоге приводят клокальному плавлению ДНК – то есть расхождению цепей сахарофосфатного остова –образованию так называемого транскрипционного пузыря, необходимого для работыРНК- полимеразы, отвечающей за процесс транскрипции [Schramm et al, 2002].Важно отметить, что так называемые TATA – содержащие промоторыприсутствуют только в 10-20 % процентов генов эукариот, а для промоторов, несодержащихTATA–последовательность,особенностипредшествующихтранскрипции взаимодействий ДНК с белками остаются плохо изученными [Schrammet al, 2002].Одной из наиболее широко известных экспериментальных моделей дляизучения изгибной жесткости ДНК является взаимодействие ДНК с ферментомДНКзой I, осуществляющим расщепление сахарофосфатного остова ДНК.
Показано,что в зависимости от нуклеотидного состава, скорости реакции расщепления ДНК14данным ферментом могут изменяться в десятки раз [Brukner et al, 1990]. Так как длярасщепления ДНК ферменту необходимо изогнуть ДНК в сторону широкой«бороздки», результаты специфичности расщепления ДНК используются для описанияконтекстнойзависимостипропорциональнойлокальнойлогарифмугибкостискоростимолекулы,реакциикотораярасщепления.Насчитаетсяоснованиирезультатов по расщеплению ДНК данным ферментом были получены эффективныепараметры,характеризующиеспецифичностьрасщеплениякнуклеотиднойпоследовательности ДНК на уровне ди- и тринуклеотидного приближения [Brukner etal, 1990; Brukner et al 1995].Известно,чтодлябольшинстваполученныхструктурДНК-белковыхкомплексов имеют место плотные контакты белка с широкой или узкой «бороздкой»ДНК.
Так, например, в случае взаимодействия одного из белков семейства HOX(семейство белков, имеющих ДНК-связывающий домен, и участвующих в регуляциитранскрипции на эмбриональной стадии развития организма) с ДНК имеет местосвязывание неструктурированной части полипептидной цепи с узкой бороздкой ДНК засчет эффекта фокусировки электростатического потенциала, имеющего место присужении бороздки [Rohs et al, 2009].Изменение параметров узкой бороздки ДНК в растворе исследуют при помощианализа картин химического расщепления ДНК различными агентами – в том числе ОН – радикалами. Считается, что эффективность расщепления ДНК определяетсяпараметрами узкой бороздки ДНК – чем уже бороздка, тем более «труднодоступным»является сахарный цикл по отношению к взаимодействию с ОН-радикалами[Greenbaum et al, 2007].
На основе данных по специфичности расщепления ДНК ОНрадикалами были получены величины, характеризующие зависимость расщепления отнуклеотидной последовательности ДНК на уровне ди, три и тетрануклеотидногоприближений [Greenbaum et al, 2007]. При помощи полученных данных былопродемонстрировано,чтофункциональныеобластиДНКобладаютсхожимиособенностями изменения вероятности расщепления вдоль ДНК [Parker et al, 2009].При анализе особенностей промоторных областей генома человека такжеиспользовались упомянутые данные по специфичности расщепления ДНК ДНКзой I[Pedersen et al, 1998]. На Рис. 1.4 приведен профиль, характеризующий среднее15изменение локальной гибкости ДНК вдоль промоторных областей в геноме человека.
Вэтой работе были отобраны 624 нуклеотидные последовательности из промоторныхобластей генов, обладающие низким уровнем сходства. Последовательности быливыравнены, после чего для каждой из них строился теоретический профиль скоростирасщепления ДНК ДНКазой I [Brukner et al, 1995]. Зависимость, представленная наРис.1.4былаполученаусреднением624профилей.Рис.1.4. Изменение вдоль ДНК логарифма отношения теоретической величиныскорости расщепления ДНК под действием ДНКзы I - k - к максимально возможномузначению скорости расщепления ko. График получен усреднением 624 профилей ихарактеризует среднее теоретическое изменение гибкости вдоль промоторныхобластейДНКчеловека.Нумерацияведетсяотносительноточкистартатранскрипции i=+1.Как видно из рисунка, область до точки старта транкрипции характеризуетсяболее низкими значениями локальной гибкости ДНК, в то время как область послестарта транскрипции – более высокими значениями гибкости.
Пик, наблюдаемый врайоне -30 нуклеотида отвечает резкому увеличению гибкости, имеющему место вTATA – содержащих промоторах. Периодическое изменение гибкости в области послеточки старта транскрипции связывают с возможностью образования нуклеосомы вданной области ДНК, в то время как низкое значение гибкости в области до началатранскрипции интерпретируют таким образом, что в таком случае уменьшаетсявероятность образования комплекса с ДНК с гистонами – процесса, нежелательного с16точки зрения возможности регуляции экспрессии гена, так как данная область ДНКсодержит сайты связывания с регуляторными белками [Cao et al, 2008].Данный пример приведен с целью демонстрации использования данных поконтекстной зависимости структурных свойств ДНК для анализа функциональныхучастков и выявления критериев поиска таких областей в геномах.
В настоящее времядля решения этой задачи используются самые разные характеристики ДНК: энергиястэкинг-взаимодействия [Abeel et al, 2008], температура плавления ДНК [Dineen et al,2009], различные конформационно-динамические параметры [Cao et al, 2008; Goni et al2007].На основе явления специфичности ультразвукового расщепления ДНК кнуклеотидной последовательности [Гроховский, 2006] в настоящее время развиваетсяновый подход к изучению контекстно-зависимых свойств ДНК [Grokhovsky et al, 2011].Как будет показано в данной работе, наблюдаемая специфичность, по всей видимости,связана с особенностями конформационно-динамических свойств сахарофосфатногоостова ДНК, проявляющимися в процессе растяжения фрагментов при их движении ввысокоградиентном потоке жидкости вблизи кавитационных пузырьков.Используемые в диссертации модели описывают процесс растяжения молекулыДНК под действием внешних сил, поэтому, в качестве введения к используемымподходам в следующем разделе приводятся некоторые результаты экспериментальныхи теоретических исследований механических свойств отдельных молекул ДНК.1.2.
Физика упругих растяжений ДНКМетоды исследования упругих свойств молекулы ДНКУпругие свойства двунитевой молекулы ДНК исследуются различнымиметодами, например, с помощью магнитных бусин [Smith et al, 1992], стеклянных игл[Cluzel et al, 1996], оптических ловушек [Smith et al, 1996; Wang et al, 1997] и атомно силовой микроскопии [Binnig et al, 1986; Hansma, 1997]. Магнитные бусиныприкрепляют к концам молекул ДНК. Внешнее магнитное поле действует на бусины,вызывая натяжение молекул.
Использование такого «магнитного пинцета» позволяетдостигать растягивающих напряжений в диапазоне 0.01 - 10 пкН (пиконьютонов). Для17получения нагрузок в интервале 0.1 - 100 пкН можно использовать методику«оптического пинцета» [Ashkin et al, 1986; Svoboda et al, 1994]. Принцип работыпинцета заключается в том, что к исследуемому образцу прикрепляется бусинка, накоторую фокусируется лазерный луч.
Изменяя мощность лазерного пучка, можнорегулировать силу светового давления на бусину, а, следовательно, и натяжениеисследуемой молекулы. Использование атомно-силовой микроскопии позволяетдостичь натяжения молекул в диапазоне 10 - 10000 пкН.Эксперименты по исследованию упругости двунитевой молекулы ДНКпоказали, что каждому диапазону сил соответствует своя природа и свой коэффициентупругих растяжений. Различают, по крайней мере, четыре различных типа поведениядвунитевой молекулы ДНК в зависимости от величины силы натяжения.Режимы упругих растяжений молекулы ДНКЭнтропийная жесткостьВследствие тепловых флуктуаций двунитевая молекула ДНК в растворепостоянно находится в «искривленном» состоянии. Это приводит к тому, чторасстояние между концами молекулы ДНК меньше ее общей длины.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
