Анализ специфичности расщепления ДНК ультразвуком (1102352), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Будем говорить,что макросостояние молекулы ДНК характеризуется расстоянием между концамимолекулы, а микросостояние - тем, как «искривлена» молекула ДНК. Растяжениемолекулы ДНК приводит к увеличению расстояния между концами молекулы, чтоуменьшает количество микросостояний, соответствующих данному макросостоянию.В этом процессе происходит уменьшение энтропии системы за счет работывнешнейрастягивающейсилы.Такимобразом,молекулаДНКоказываетсопротивление растяжению, что в терминах механики можно описать как проявлениежесткости молекулы.
Такую жесткость молекулы ДНК называют энтропийнойжесткостью [Bustamante et al, 1994].Для теоретического описания энтропийной жесткости ДНК используются двемодели. В модели «свободно сочлененной цепи» полагается, что молекула ДНКсостоит из независимо ориентированных сегментов, длина b которых определяетсяжесткостью молекулы. В модели «червеобразной цепи» молекула ДНК считаетсясгибаемым стержнем длины L, слабо искривленным вследствие тепловых флуктуаций.Для такого стержня можно ввести понятие персистентной длины P, т.е.
расстояния, на18котором наблюдается корреляция между начальным и конечным сегментами стержня.Определение персистентной длины выглядит следующим образом:(n, n') e s / P(1.3),где:nи n' - векторы нормали к двум элементам стержня, находящимся нарасстоянии s друг от друга, а (n, n')среднеезначениеихскалярногопроизведения. Чем жестче молекула, тем больше величина P. Персистентная длинадвунитевой молекулы ДНК в водно-солевом растворе составляет примерно 50 нм, т.е.около 150 пар оснований.В работе [Bustamante et al, 1994] приведена приближенная формула расчетаудлинения x в зависимости от длины молекулы L и действующей на нее силы F ,полученная на основе червеобразной модели ДНК:FP1x 1 2k BTL 4 x41 L(1.4),где: kB – константа Больцмана, T – температура. При малой величине отношения x/Lформула (1.4) переходит в закон Гука:F3k BT x2P L(1.5),с коэффициентом жесткости kДНК = 3kBT/2PL, обратно пропорциональным общей длинеи персистентной длине молекулы.
Для двунитевой молекулы ДНК длиной 10 мкмкоэффициент жесткости, рассчитанный в соответствии с (1.5), равен приблизительно10-5 пкН/нм. Такое же выражение для коэффициента жесткости можно получить и вмодели свободно сочлененной цепи [Grosberg et al, 1994], приняв размер сегментаравным b = 2P.Эксперименты по исследованию упругости молекулы ДНК показали границыприменимости этих двух моделей. Оказалось, что модель свободно сочлененной цепихорошо описывает поведение молекулы при нагрузках до 0.1 пкН.
Важно отметить, что19модель червеобразной цепи может быть применена в более широком диапазоне сил0.01 -10 пкН. Сравнение экспериментальных данных с теоретическими кривымиприводится на Рис. 1.5.Собственная эластичностьВыше упоминалось, что предложенные модели не могут описать поведениемолекулы ДНК при нагрузках выше 10 пкН. Действительно, при увеличении нагрузокрасстояние между концами молекулы ДНК данной длиныстановится большерасстояния между концами молекулы ДНК в В – форме. При таких нагрузках структурамолекулы ДНК меняется, и основной вклад в жесткость молекулы уже не являетсяэнтропийным.
Эксперименты, проделанные оптическим пинцетом, демонстрируютналичие упругих растяжений в интервале нагрузок 5 - 50 пкН.Если в модели «червеобразной цепи» учитывать внутренние упругие свойствастержня, то в первом приближении, полагая, что общая длина молекулы ДНКвозрастает линейно с ростом приложенной силы, получаем:xLFS(1.6),где: S – модуль растяжения стержня, связанный с его персистентной длиной Pсоотношением: P Sr 2где r - радиус стержня.4k BTОптимальное согласие формулы (1.6) c опытами, проделанными с помощьюоптического пинцета [Smith et al, 1996; Wang et al, 1997] в растворе 150 мМ Na+получается при S равным примерно 1000 пкН.B-S переходЭкспериментальные данные, представленные на Рис.
1.6 , показали, что когдамолекула ДНК испытывает нагрузки около 65 пкН или больше, она резко меняет своюструктуру, растягиваясь на 70% по сравнению с канонической B–формой [Cluzel et al,1996; Smith et al, 1996], то есть происходит переход в так называемую S–форму,20различные модели которой ждут своего экспериментального подтверждения. Переходиз B в S форму происходит кооперативно и в очень узком диапазоне сил. Придальнейшем увеличении нагрузок поведение S–ДНК становится таким же, как у двуходнонитевых молекул ДНК. Таким образом, S–ДНК разделяется на две нити, т.е.происходит ее плавление.Рис.
1.5.Экспериментальные и теоретические зависимости растяжения x/Lдвунитевой молекулы ДНК от приложенной силы F [Bustamante et al, 1994].«x» – экспериментальные значения; зеленая и синяя кривые «―» и «―» отвечаюттеоретически рассчитанным зависимостям по модели червеобразной цепи при P = 53нм (синяя кривая соответствует точно рассчитанной зависимости, а зеленая –экстраполяции в соответствии с формулой (1.4) ); черная кривая «―» соответствуетзависимости, полученной в рамках модели свободно сочлененной цепи при b = 2P = 106нм, а коричневая кривая «―» соответствует закону Гука (1.5).21Рис. 1.6.Экспериментальная зависимость растяжения x/L двунитевой иоднонитевой молекул ДНК от приложенной внешней силы F [Bustamante et al, 1994].«―•―» - растяжение двунитевой молекулы ДНК, «– –» - расчетная кривая поуравнению (1.6), «▲».
«■», «○»– растяжение однонитевой молекулы ДНК в 2 мМ Na+,5 мМ Мg2+ и 150 мМ Na+ соответственно.Разрыв ковалентных связей в молекуле ДНККакое натяжение необходимо, чтобы разорвать ковалентные связи в молекулеДНК? Теоретические оценки показывают, что данная сила должна превышать 5000пкН. Однако в экспериментах в движущемся потоке разрыв молекул ДНК происходилуже при 100-300 пкН.
Единичные двунитевые молекулы ДНК, растянутые водныммениском, разрывались при 960 пкН [Bensimon et al, 1995]. Короткие двунитевыемолекулы ДНК в атомно-силовой микроскопии [Lee et al, 1994] выдерживалинатяжение более 1700 пкН. Весьма сложно установить истинное значение силы,необходимой для разрыва двунитевой молекулы ДНК, т.к. она оказывается зависящейот длины молекулы и свойств растворителя. У полисахаридных молекул в водномрастворе сила, необходимая для их разрыва, была определена при помощи атомносиловой микроскопии и составляет около 1000 пкН [Grandbois et al, 1999].221.3.
Расщепление полимеров под действием ультразвука.Явление ультразвукового расщепления полимерных соединений в раствореактивноиспользуетсявсамыхразныхтехнологическихоперациях.Важнойособенностью данного процесса является то, что крупные молекулы расщепляютсянамного эффективнее, чем короткие, позволяя существенным образом изменятьраспределение компонентов раствора по степени полимеризации.Характерные особенности процесса расщепления полимеров под действиемультразвука высокой интенсивности свидетельствуют о том, что данное явлениеотносится к классу так называемых механохимических реакций – то есть реакций,катализируемых действием механических сил [Basedow et al, 1977].
Механохимическаяреакцияявляетсясложныммногостадийнымпроцессом,которыйвключаетмеханическую деформацию молекулы, предшествующую химической реакции. Вслучае ультразвукового расщепления полимеров в растворе, деформация молекулывозникает в результате действия гидродинамических сил. Силы, приводящие красщеплению полимеров под действием ультразвука высокой интенсивности, связаны скавитационными процессами, которые происходят в озвучиваемом растворе [Basedowet al, 1977].В соответствии с теорией механохимических реакции [Бутягин, 1971],существует два прямых механизма перехода механической энергии в энергию,необходимую для протекания химической реакции.
Первый механизм связан смеханической деформацией химической связи – изменением межатомных расстояний идеформацией электронных облаков под действием внешней силы, а второй – свозбуждением колебательных степеней свободы связи при локальном разогревемолекулы, связанным с переходом механической энергии деформации в тепло.Первый механизм можно считать равновесным процессом, если характерноевремя действия внешней силы намного превышает время релаксации к распределениюМаксвелла-Больцмана. Второй механизм связан с существенно неравновеснымпроцессом и применим к описанию реакций в случае действия импульсных сил –например, при действии ударных волн. Кинетика механохимической реакции в первомслучае может быть описана в рамках теории активированного комплекса – или наоснове модифицированного уравнения Аррениуса [Schmidt et al, 2008], что будетиспользовано в третьей главе диссертации.23Акустическая кавитацияПод явлением акустической кавитацией понимается совокупность процессов,связанных с образованием в озвучиваемом растворе так называемых кавитационныхпузырьков.
Образование пузырьков является результатом разрыва жидкости поддействием отрицательных давлений ультразвука: в фазе разряжения звуковой волны наимеющихся в жидкости микропузырьках образуется разрыв в виде полости, котораязаполняется насыщенным паром и диффундирующим в нее растворенным газом. Вфазе сжатия пар конденсируется, а имеющийся в полости газ подвергается сильномусжатию. В момент «схлопывания» давление и температура газа достигают высокихзначений, что порождает в близкой окрестности пузырька импульс высокого давления.Акустическая кавитация представляет собой эффективный механизм концентрацииэнергии.
При кавитации относительно низкая средняя плотность энергии звуковогополя трансформируется в высокую плотность энергии в малом объеме внутри и вблизисхлопывающегося пузырька. Полная энергия захлопывающегося пузырька невелика,однако сферическая сходимость пузырька приводит к образованию очень большихлокальных плотностей энергии, а, следовательно, высоких температур и давлений[Brennen, 1995].Модель расщепления полимеров под действием акустической кавитации.Экспериментальные данные, а также теоретические расчеты свидетельствуют отом, что при определенных условиях схлопывание кавитационного пузырька можетвызывать высокоградиентные течения в окружающей жидкости, достаточные дляразрыва полимерных молекул [Эльпинер, 1973; Basedow et al, 1977].В настоящее время общепринятой является модель расщепления, предложеннаяТомасом [Thomas, 1959]: при схлопывании кавитационного пузырька возникаетсильный радиальный градиент скорости течения жидкости, который приводит крастяжению полимера и, в конечном итоге, к его расщеплению (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
