Сканирующая силовая микроскопия полимерных структур на подложке (1097877), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Показано, что степень занижения высот адсорбированных объектов зависит от силы воздействия зондирующей иглы микроскопа и, при условиикалибровки, позволяет количественно определять упругие параметры адсорбированных наноразмерных объектов.Проанализировано достижимое латеральное пространственное разрешениеССМ. Обосновано утверждение, что визуализация двумерной упорядоченнойструктуры с субнанометровым периодом упаковки молекул еще не может служить индикатором достижимости субнанометрового разрешения в ССМ.
По–9–казано, что достижимое пространственное разрешение определяется характерным латеральным размером области взаимодействия зонда и образца, который,для стандартно используемых коммерческих игл и при исследованиях на воздухе, характеризуется нанометровым значением. Обсуждается, каким образомэто значение сочетается с особенностями ССМ-визуализации двумерных упорядоченных молекулярных структур.Подробно рассмотрена общая методология эксперимента с использованиемССМ. Проанализированы возможные варианты выбора подложки для адсорбции подлежащих исследованию наноразмерных полимерных объектов. Уделено внимание методам модификации поверхностных свойств подложек и возможным способам нанесения объектов на подложку из растворов.
Рассмотрены условия приготовления растворов и требования к качеству растворителей.Описаны особенности некоторых моделей современных сканирующих силовыхмикроскопов.Сопоставлены возможности ССМ и сканирующей туннельной микроскопиив исследованиях макромолекул. Проведено сопоставление ССМ и современныхметодов оптической микроскопии высокого разрешения: лазерной сканирующей конфокальной (флуоресцентной) микроскопии, многофотонной флуоресцентной микроскопии, STED микроскопии, микроскопии ближнего поля, а также микроскопии дифференциально-интерференционного контраста.
Показано,что, хотя методы оптической микроскопии как ближнего, так и дальнего поляпреодолели в своем развитии классический оптический предел разрешения идостигли разрешающей способности на уровне десятков нанометров, они всееще уступают по этому параметру ССМ и поэтому в меньшей степени применимы для задач прямого исследования пространственной структуры наноразмерных полимерных объектов. С другой стороны, отмечено принципиальноедостоинство современных оптических методов, состоящее в возможности исследовать оптические характеристики даже одиночных макромолекул, что дает косвенную информацию о структуре, мобильности и взаимной ориентациивитков цепи, а также о локальном окружении мономерных звеньев.На основе анализа литературных данных и некоторых результатов проведенных автором исследований, дан анализ возможностей ССМ в противопоставлении с методологически наиболее близкими ему методами сканирующейи просвечивающей электронной микроскопии (СЭМ и ПЭМ).
Подчеркиваетсяактуальность такого анализа в свете достигнутого прогресса в развитии методов электронной микроскопии, обусловленного применением автоэмиссионныхкатодов, энергетических фильтров, крио- приставок, реализацией схем аппаратной коррекции аберраций, увеличением чувствительности детекторов, развитием математического аппарата анализа изображений и т.д.–10–По результатам проведенного сопоставления ССМ и СЭМ сделан выводо целесообразности использования ССМ для исследования гладких поверхностей с фактором шероховатости, близком единице.
К этой категории относится задача анализа морфологии наноразмерных структур, адсорбированных наповерхность гладких подложек. Именно такой класс объектов является предметом исследования в рамках настоящей научно-квалификационной работы.Показано, что, применительно к решению подобных задач, возможности ССМцелесообразно анализировать в противопоставлении с возможностями ПЭМ.На основе анализа литературных данных сделано утверждение, что метод ПЭМ может быть более универсальным и более информативным, чем метод ССМ, если ставится задача рутинной визуализации статической морфологии наноразмерных полимерных структур, включая одиночные макромолекулы.
Чувствительности и разрешающей способности современных просвечивающих микроскопов вполне достаточно для визуализации даже одиночных цепей гибкоцепных полимеров. Обсуждаются преимущества ПЭМ, касающиесявозможностей выполнения контрастирования (включая селективное), извлечения информации о внутренней трехмерной структуре исследуемых наноразмерных полимерных объектов, проведении локального элементного анализа и фиксации для наблюдений состояния полимерных структур в растворахметодом быстрой заморозки (крио ПЭМ).
Важным достоинством ПЭМ является бо́льшая производительность, обусловленная экспрессностью оценки общей морфологии поверхности пленки-подложки с нанесенными структурами ималым временем накопления каждого изображения. Отмечено, что, при визуализации статической морфологии, некоторые преимущества ССМ над ПЭМмогут проявиться в связи с маскирующим эффектом от гранулярного рельефаизображений чистой пленки-подложки на микрографиях ПЭМ при решениинекоторых частных задач детектирования присутствия / отсутствия на подложке слабоконтрастных структур (например, одиночных полимерных цепей).На основе проведенного анализа литературных данных и результатов рядаранних работ автора формулируется утверждение о том, что бесспорно выигрышным нишевым применением метода ССМ является прямое наблюдениеиндуцированных трансформаций адсорбированных полимерных структур наподложке под внешним воздействием, особенно в жидком или паровом окружении.
В качестве частных примеров таких приложений описаны результатывизуализации конформационных изменений молекул ДНК при вариации условий жидкого окружения (включая некоторые результаты, полученные автором), а также визуализации процессов взаимодействия и связывания молекулДНК с белками. Другим примером являются результаты, изложенные в Главе3, по визуализации конформационных переходов макромолекул на подложке,индуцированных влиянием паровой фазы.–11–В заключении первой главы, в целом, охарактеризована перспективностьприменения ССМ в ряде нишевых направлений и поставлены задачи настоящего исследования, решения которых изложены в последующих главах.Глава 2. Количественный анализ конформации полимерных цепейПолимерные цепи различной природы и строения в процессе адсорбции на подложку принимают разную конформацию.
Эти отличия заметны «визуально»при наблюдении макромолекул с помощью ССМ. Более того, конформациямолекул на подложке может изменяться с течением времени, в том числе, подвоздействием внешних факторов (при экспозиции в парах, жидкостях, вариации температуры и т.п.). При интерпретации результатов подобных наблюдений удобно было бы оперировать каким-либо количественным параметром,характеризующим тип конформационного состояния макромолекул. Причем,в силу известных артефактов ССМ, проявляющихся в систематическом искажении характерных размеров визуализируемых объектов, желательно выбратьтакой параметр, на определении которого аппаратные искажения и погрешности ССМ не сказывались бы.Во второй главе, в сопоставлении с литературными данными, рассмотренывозможные способы количественного описания конформации полимерной цепипо результатам визуализации с помощью методов микроскопии высокого разрешения.
Показано, что для сравнительного анализа ССМ изображений макромолекул достаточно удобным является оперирование показателем ν, определяющим характер соотношения средних значений квадратов расстояний междуc2 и их контурных длин L:концами полимерных цепей Rc2 = const × L2ν .R(1)Значения этого параметра могут быть рассчитаны, исходя из статистическогоанализа изображений макромолекул на микрографиях микроскопии высокогоразрешения. Показано, что ограниченное пространственное разрешение ССМ,часто не позволяющее визуализировать тонкую конформационную структуруадсорбированных макромолекул и приводящее к систематическим занижениямизмеряемых значений контурных длин, не приводит к ошибкам в определениипоказателя ν, в отличие от некоторых других параметров, количественно описывающих конформацию макромолекул, в частности, префактора const.Значение показателя ν, измеренное для ансамбля макромолекул, в сочетании с оценкой степени подавленности самопересечений адсорбированных полимерных цепей, может служить критерием отнесения их конформации к томуили иному типу: жестких стержней (ν = 1), двумерного клубка с исключенным объемом — модель самоизбегающих блужданий (ν = 3/4, самопересечения–12–подавлены), двумерной (квази)проекции трехмерного клубка (ν ' 0.59, самопересечения разрешены), двумерного θ-состояния (ν ∼ 4/7, самопересеченияподавлены), двумерной компактной глобулы (ν = 1/2, самопересечения подавлены), трехмерной компактной глобулы (ν = 1/3) и т.п.Развитая в работе процедура определения показателя ν основана на анализе микрографий, когда для каждой индивидуальной визуализированной полимерной цепи измеряется контурная длина Li и расстояние между концами Ri .Затем используется способ усреднения, которой включает, на первом шаге, сортировку массива N экспериментально измеренных пар Li , Ri2 по возрастаниюзначений Li , далее, на втором шаге, разбиение отсортированного массива нагруппы по n пар значений в каждой и усреднение значений Li и Ri2 в пределахкаждой группы.
Это позволяет определить набор усредненных значений квадc2 k , соответствующий ему набор среднихрата расстояния между концами цепи Rb k , а также соответствующие наборы стандартныхзначений контурной длины Lошибок средних арифметических.Таким образом, введенная процедура усреднения редуцирует исходный массив N пар экспериментально измеренных значений Li , Ri2 до нового массива сменьшим общим числом элементов N/n, которое определяется глубиной усреднения (редуцирования) n. В работе рассмотрена проблема выбора оптимальныхзначений глубины усреднения n, исходя из следующего критерия:1 n N.(2)Поскольку оказывается, что для подавления флуктуаций усредненных точек (ифлуктуаций их аппроксимаций) желательно, чтобы значение n удовлетворяло,по крайней мере, условию n ≥ 20, из соотношения (2) следует, что необходимоизмерить параметры, по крайней мере, нескольких сотен макромолекул. Такаявыборка позволяет снизить погрешность определения ν до единиц процентов.Задача нахождения ν сводится к проблеме поиска корректной аппроксиc2 k от Lb k функцией вида (1), где ν фигурирумации зависимости значений Rет в качестве варьируемого параметра аппроксимации.
В работе сопоставлены три процедуры поиска аппроксимации, различающиеся, с одной стороны,удобством использования, а с другой — степенью учета при построении апc2 k ипроксимации стандартных ошибок рассчитанных средних значений: ∆Rb∆Lk . Наиболее полный учет этих погрешностей реализован в процедуре, которая состоит в численной минимизации взвешенной χ2 -функции относительнозначений const и ν:2c2 k − const × LN/nb 2νRXkχ2 (const, ν) =(3)2 2 2ν−12cbbk=1const × 2ν Lk∆Lk + ∆R k–13–Погрешность рассчитываемой величины ν определяется минимальным имаксимальным значениями этого параметра, при которых зависящая от негофункция χ2 (const, ν) отличается от своего найденного минимума χ2min не более,чем на единицу:χ2 (const, ν) − χ2min = ∆χ2 ≤ 1,(4)причем при всех возможных значениях const.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
