Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов (1097487), страница 6
Текст из файла (страница 6)
БАВ и суммы флавоноидов в пересчете на рутин.
Валидационной проверке подвергались методики качественного и количест-венного определения биологически активных веществ: полифенолов, флавоно-идов и агримониина квалификационные исследования заключались в оценке их воспроизводимости и устойчивости стандартных растворов, подверженных ли-нейной зависимости аналитического сигнала от концентрации определяемого вещества, достигаемой чувствительности определения, расчете метрологичес-ких характеристик и выявлению систематических погрешностей анализа. Резу-льтаты валидации показали высокую чувствительность определения (до 0,005 %) и строгость линейных зависимостей аналитических сигналов от содержания флавоноидов (коэффициенты корреляции составили 0,998), что определяет вы-сокую точность анализа. Это выражается в хорошей воспроизводимости резу-льтатов, а также в статистически доказанной правильности определения.
Сделанные выводы дают возможность считать разработанную методику при-годной для достоверного количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин для травы манжетки.
При разработке системы мероприятий, способствующих сохранению качест-ва сырья до его применения, необходимо учитывать динамику содержания и фи зико-химические свойства БАВ, содержащиеся в нём.
Таблица 7. Содержание суммы флавоноидов в траве манжетки
в зависимости от сроков хранения
Год проведения сбора| Содержание суммы флавоноидов, %
1996 2,85±0,15
1995 2,78±0,25
1994 2,07±0,18
1993 1,78±0,28
1992 1,75±0,33
До 1997 года собирали всю надземную часть манжетки, не отделяя черешки и жёсткую часть цветоносов.
Так как в траве манжетки флавоноиды относятся к одной из главных групп дей-ствующих веществ, обуславливающих основные фармакологические эффекты, проводили изучение стабильности содержания суммы флавоноидов в траве манжетки, заложенной на хранение в 1992 году в сухом, защищенном от света месте. Проведенное исследование показало, что со временем (по истечении двух лет хранения) этот показатель значительно уменьшается, сырье выгорает. Результаты спектрофотометрического определения содержания суммы флаво-ноидов в пересчете на рутин представлены в таблице 7, где видно, что хранить траву манжетки дольше двух лет нерационально.Таким образом, трава манжет-ки должна храниться по общему списку в защищенном от света, хорошо проветриваемом помещении не более двух лет.
Срок годности экспериментально установлен – 2 года.
Ресурсоведческое исследование
На основании проведенного ресурсоведческого исследования природных по-пуляций манжетки установлено, что для изученных популяции характерно до-минирование A.gracilis (до70%), A.baltica(15%), A.subcrenata (10%) и все оста-льные виды составляют менее 5% * (рис.13); определено, что проективное пок-рытие в среднем охватывает 70±15% учетной площадки; сбор свежего сырья должен составлять около 50% от всей биомассы, одна особь при этом дает 20-35 грамм
свежего сырья, занимая площадь от 0,25 до 0,50 м²; коэффициент усушки – со-ставил 4. В результате расчетов определено, что 1% проективного покрытия даёт 0,9±0,1 грамм сухого сырья при ежегодной заготовке сырья с соблюде-нием ресурсосберегающих требований. 
Рис.13. Диаграмма соотношения видов Alchemila в популяции
Манжетка входит в ценокомплекс в составе злаково-манжетково-разнотрав-
ной ассоциации; разнотравье представлено следующими видами: купырь лес-ной – Anthriscus silvestris (L) Hoffm, дудник лесной–Angelica sylvestris L., хвощ лесной – Equisetum sylvaticum L., вербейник монетчатый – Lysimachia nummu-laria L., герань лесная – Geranium sylvaticum L., лапчатка прямостоячая – Poten-tilla erecta (L.) Raeusch., вероника дубравная–Veronica chamaedrys L.,горошек заборный -Vicia sepium L.,зверобой пятнистый – Hypericum quadrangulum L.,и др.Эти виды могут попадать в сырье, как органическая примесь (не более 10%).
Расчеты среднего выхода сырья с одного квадратного метра проводили за пять лет. Они составили: 56,325,87г(2001г), 45,463,45г(2002г),
65,678,35г(2003г), 35,524,57г(2004г); 72,269,06 г(2005г).
Проанализировав полученные данные, установили, что урожайность травы манжетки находится в зависимости от погодных факторов вегетационного пе-
риода, при этом выход сухого сырья травы манжетки может составлять в сред-нем до 5,5 ц/га.
Таким образом, нами установлено, что манжетка образует сплошные невы-сокие заросли – «куртины», поэтому определение урожайности можно прово-дить по проективному покрытию, «цена» 1% будет равна около 0,9 г, а урожай-ность травы манжетки в среднем составляет 5,5 ц/га. Т.о. установлен объем ежегодных заготовок.
Определение острой токсичности и специфической активности травы манжетки показало, что настой из нее относится к классу нетоксичных, макси-мально переносимая доза настоя МПДLD10. Установлено, что настой травы манжетки обладает антиметастатическим действием (ТРМ более 25%) при ран-нем начале лечения (на модели опухоли карциномы Льюис), при этом настой обладает способностью ингибировать процесс рецидивирования опухоли у жи-вотных. При пероральном введении настоя травы манжетки мышам в дозе 7,0 мг/кг способствует снижению метастазирования саркомы 37 на 29%. По пред-варительным данным настой травы манжетки в дозе 13,7 мг/кг per os значите-льно увеличивает среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой-37 в сравнении с контролем. Также определена перспективность его применения при комбинированной терапии.
Обсуждение результатов Лекарственные растения, применяемые отечест-венной народной медициной составляют более 600 видов, а разрешенных к ме-дицинскому применению, включенных в Государственный Реестр – 260 видов, причем многие из них не образуют промышленно значимых зарослей или вклю чены в Красную Книгу. Кроме того, ухудшение экологической обстановки, ант-ропогенное воздействие на места обитания многих ценных лекарственных ви- дов сокращают их природные запасы. Все это вызывает необходимость актив-нее изучать и внедрять лекарственные растения народной медицины для расши-рения сырьевой базы получения отечественных лекарственных средств.
Для этого необходимо разработать научно обоснованные методические под-ходы к изучению лекарственных растений Флоры России, создать алгоритм, по-
Схема 1. Алгоритм изучения лекарственных растений.
зволяющий наиболее полно изучать и эффективно внедрять их в научную ме-дицину.
Научно обоснованная схема изучения лекарственных растений народной ме-дицины должна содержать следующие этапы:
-Выявление лекарственного растения наиболее часто применяемого для лечения определенного вида патологий;
-Изучение жизненного цикла растения и возможности введения его в культуру;
-Изучение природной сырьевой базы;
-Выявление биологически активных веществ, определяющих фармакологическую активность лекарственного сырья;
-Определение показателей подлинности и качества сырья;
-Разработка нормативных документов на сырье
- Изучение биологической активности
- Клинические испытания
и представлена на схеме 1.
На основании этого алгоритма были проведены исследования для разработ-ки нормативных документов. Результаты исследования перспективных лекарст-венных растений были положены в основу методических указаний по изучению растений Флоры России.
В результате изучения особенностей биологии лекарственных растений бы-ло установлено, что для идентификации видов, обладающих аберратными фор- мами размножения необходимо использовать молекулярно-биологические ме-тоды анализа. Они позволяют четко очертить круг видов, относящихся к расте-
ниям, производящим сырье, а также определить его подлинность в препаратах из него высокой степени измельчения.
Поскольку эти методы достаточно точны, доступны, воспроизводимы и рас-ширяют возможности фармакогностического анализа, считаем необходимым включить нормативные документы на них в последующее издание Государст-венной Фармакопеи.
Проведенные исследования позволили разработать методические подходы (алгоритм) для изучения лекарственных растений народной медицины, облада-ющих сложной таксономией и аберратными формами размножения, образую-щих агамные комплексы и др. Схема 1., а также разработать нормативные доку-менты на перспективное лекарственное растительное сырье трава манжетки (проект Фармакопейной статьи и Инструкции по сбору и сушке), кроме того, проект общей Фармакопейной статьи «RAPD-анализ лекарственного расти-тельного сырья».
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. С помощью RAPD-анализа на примере рода манжетка проведено изучение геномов перспективных лекарственных растений, определён характер измен-чивости в популяциях рода и установлена генетическая дистанция между ви дами рода, что позволило подойти к решению проблемы внутривидовой и по-пуляционной изменчивости.
2. Изучена взаимосвязь между строением геномов видов рода манжетка и стабильностью химического состава БАВ. В качестве химических маркеров определены рутин, гиперозид, галловая и кофейная кислоты, агримониин, пролин и оксилизин.
3. Разработаны критерии оценки подлинности и качества сырья – трава ман-жетки, как перспективного лекарственного сырья для отчественной медицины, эти данные вошли в проекты Фармакопейной статьи и Инструкцию по сбору и сушке.
4. Изучение полифенольного состава травы манжетки от разных производящих видов показало его сходство и позволило дать чёткие рекомендации по сбору сырья.
5. Показана возможность применения RAPD для видоидентификации лекарст-венного растительного сырья и молекулярно-биологических методов для даль-нейшего изучения лекарственных растений на примере 17 видов сырья растений, относящихся к 11-ти родам и к 7-ми семействам. Разработан проект Общей Фармакопейной статьи «RAPD-анализ лекарственного растительного сырья».
6. Установлена возможность использования применения секвенирования ДНК перспективных и лекарственных растений с использованием последовательнос-тей внутренних транскрибируемых спейсеров рибосомного оперона яд ДНК (ITS 1-2),хлоропластного интрона гена rps16 (rps16) и хлоропластного маркера, включающего участок экзона petB, межгенный спейсер и интрон гена petD (petB-petD) и на примере рода Аnthylis L.,и проведен филогенетический анализ видов рода Anthyllis и близких родов.
7. Выявлено отсутствие токсичности и определена специфическая активность настоя травы манжетки.
8. Определена урожайность перспективного сырья – трава манжетки: при еже-годных заготовках с соблюдением ресурсосберегающих условий, она состав-ляет до 5,5 ц/га.
9. В результате проведенного фармакогностического изучения перспективных лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических мето-дов обобщенны экспериментальные данные и дано теоретическое обоснование необходимости и возможности их применения при комплексном изучении пер-спективных лекарственных растений, применяемых в народной медицине.
10. Разработан алгоритм изучения сложных в таксономическом отношении ви-дов и родов этих растений в том числе и обладающих аберратными формами размножения.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Баева В.М. Динамика накопления дубильных веществ цветков иван-чая узко-листного по фазам онтогенеза.-Деп.во ВНИИМИ, МРЖ, № 6, 1986, раздел ХХП, публ.1051.
2. Баева В.М., Барабанов Е.И. «Микроэлементный состав иван-чая узколист-ного и препарата “Ханерол” // Фармация, 1994, № 6.-С.4-6.
3. Баева В.М., Павкин А.В.”Морфолого-анатомические особенности строения представителей рода манжетка”.-Сб.”Актуальные вопросы медицины”- Материалы Всероссийской студенческой конференции, посвященной 50-летию АМН России, 4-6 октября 1994.М., 1994. – С.60.
4. Баева В.М., Сасов С.А.”Сравнительное изучение химического состава пред-ставителей рода манжетка”.- “Современные аспекты изучения лекарственных растений”. - Научные труды, т. ХХХ1У, М.- 1995.- С.242-244.
5. Баева В.М., Боброва В.К.”Сравнительное изучение геномов представителей рода манжетка”.- Материалы докладов Российской национальной конференции “Формирование приорететов лекарственной политики”.М., 1995 28-29 июня. – С.165-166.
6. Баева В.М., Боброва В.К.”Геномный анализ рода манжетка”.- Тезисы док-ладов Первого международного симпозиума “Новые и нетрадиционные рас-тения и перспективы их практического использования” (1-5 августа 1995 г) Пущино – 1995.- С.24-25.
7. Баева В.М. “Изучение манжеток ботанического сада ММА им. И.М.Сече-нова” “Лекарственные растения ботанического сада” – Материалы тезисов научной конференции, посвященной 50-летию ботанического сада ММА им. И.М.Сеченова.- М., 1996. – С.40.
8. Баева В.М., Боброва В.К. «RAPD – перспективный анализ для изучения лекарственных растений». – Научные труды: «Фармацевтическая наука и практика в новых социально-экономических условиях», т. ХХХ1У, часть П. М., 1997.-С.174-177.
9. Баева В.М., Володин Ю.Ю., Толкачёв В.Н. Спектрофотометрическое опре-деление суммы флавоноидов манжетки // Международный конгресс по анали-тической химии 15-21 июня 1997 г. Тесизы докладов, М., 1997. – Россия. Абстракт, № 2. – С.46.
10. Баева В.М., Боброва В.К., Троицкий А.В., Антонов А.С. RAPD-анализ ДНК рода манжетка // Фармация, 1998 № 2.- С.38-41.
11. Баева В.М. Перпективы применения геномного анализа для изучения лекарственных растений // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г. – С. 345.
12. Баева В.М., Глазунова К.П. Применение пыльцевого анализа для опреде-ления качества лекарственного растительного сырья». У Российский нацио-нальный конгресс «Человек и лекарство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998 г.- С.346.
13. Баева В.М., Глазунова К.П. Манжетка обыкновенная –перспективное ле-карственное растение // У Российский национальный конгресс «Человек и ле-карство». Тезисы докладов. М., 21-25 апреля 1998. – С.358.
14. Баева В.М., Сасов С.А. Флавоноидный состав цветков иван-чая узко-листного // У Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Тезисы докладов, М., 21-25 апреля 1998.- С. 358-359.
15. Баева В.М. Микроэлементный состав травы манжетки // Материалы науч-но-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные на-правления и перспективы развития». МЗ РФ. М., 14-16 мая 1998. – С.109.
16. Баева В.М., Глазунова К.П. «Применение пыльцевого анализа для опреде-ления загрязнённости лекарственного растительного сырья». Сб. «Фармацевти-ческая наука в решении вопросов лекарственного обеспечения». Научные тру-ды, том ХХХУП, ч. П, М., 1998.- С.145-149.
17. Baeva V.M., Sepp S., Antonov A.S. et and. Genetic and morfological variabiliti in same microspecies of agamous Alchemilla L. Ineternacional Symposium “Plant Evolution in Man-made Habitats. – August 10-15.1998. – S. 93.
18. Баева В.М., Глазунова К.П. Изучение морфо-генетической изменчивости у видов рода манжетка // Сб. «Современные проблемы фармацевтической науки и практики». Научные труды, том ХХХУШ, ч. П. М., 1999.- С.155-158.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
