Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 4)

Рис. 4. Фенограмма сходства RAPD-спектров ДНК видов

Рода Alchemilla, построенная методом UPGMA по данным

матрицы в таблице 1; d –процент различий

S. Fröhner (1990), но поV. Rothmaler (1936) они принадлежат, соответственно, к двум подсекциям. Образцы A.semilinaris образуют монофилетическую линию, а все образцы A.subcrenata объединяются вместе и близки к образцам секции Plicatae. A.acutiloba и A.gracilis перемешаны друг с другом, но по-видимому, вместе образуют монофилетическую группу. Положение A.glabricaulis и A.bal-tica неопределённо. A.gracilis, по-видимому, образует отдельную ветвь. Все ос-тальные виды расположены вперемешку друг с другом и не могут считаться монофилетическими.

Расшифровка радиограмм и электрофореграмм, компьтерная математическая обработка полученных результатов анализа показала отсутствие в изучаемых популяциях манжетки предковых видов и невозможность построения из этих видов филогенетического дерева, хотя некоторые наборы RAPD-фрагментов были сходны для нескольких видов, особенно взятых из одного фитоценоза,

что может говорить о их гибридогенном происхождении. Величина внутриви-довой и внутрипопуляционной изменчивости оказалась очень высокой.

Таким образом, применение геномного анализа позволило характеризовать геномы видов манжеток, преимущественно как гибридные, что дает возмож-ность рекомендовать для сбора траву всех видов манжеток, как близкородст-венных и обладающих сходным биосинтезом БАВ, что дает возможность про-гнозировать близкий состав биологически активных веществ.

Применение RAPD – анализа для идентификации

лекарственного растительного сырья.

В отечественной и мировой литературе отсутствуют данные о применении молекулярно-биологических методов для изучения лекарственного раститель-

Рис. 5. Электрофореграмма амплификатов ДНК свежих и высушенных

листьев двух видов дуба-Quercus с праймером 3‘-CGGCCCCTGT-5‘

1-молекулярный маркер; 2-контрольный опыт;

3-фрагменты ДНК свежих листьев дуба черешчатого;

4-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба черешчатого;

5-фрагменты ДНК высушенных листьев дуба красного

ную для его идентификации. Прежде всего необходимо было адаптировать ме-тодику выделения ДНК из сухого сырья и подобрать условия амплификации.

Наилучшими оказались следующие условия проведения реакции амплифика-ции для термоциклера фирмы Perkin Elmer-Cetus Instruments:

- денатурация – 94˚С – 1 мин; отжиг – 36˚С – 1мин; синтез – 72˚С -1 мин.

( В последнем цикле эта стадия длится 3 мин). При сравнении результатов ампли-фикации установлено, что RAPD-набор ДНК свежего и высушенного сырья от-личается по количеству и расположению фрагментов, вследствие деградации ДНК при сушке (рис. 5). Разделение и обнаружение фрагментов ДНК, получен-ных в результате реакции амплификации, проводили методом электрофореза в 2 % геле агарозы. Выделение и амплификацию ДНК из сухого сырья: цветков

с листьями боярышника кроваво-красного и боярышника кавказского, травы череды трёхраздельной и череды поникшей,а также цветков иван-чая узколист-

Рис. 6. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma)

продуктов RAPD ДНК растительного сырья:

1- боярышника крововокрасного - Crataegus sanquinea Pall.),

2- боярышника кавказского - Crataegus caucasica C.Koch. Cratz.et Mesp.

3- череды трёхраздельной - Bidens tripartitus L.

4- череды поникшей - Bidens cernuus L.

5- иван-чая узколистного - Chamaenerium angustifolium (L.) Scop.

6- иван-чая узколистного - Ch. angustifolium var. albiflorum Hausskn.

7- горца почечуйного (красного)- Polygonum persicaria L.

8- горца почечуйного (зеленого)- Polygonum persicaria L.

М – маркер длины (перевар ДНК фага λ рестриктазой Psd)

ного (розовой формы и белой), травы горца почечуйного (растущих рядом зелё-ной и красной) проводили по модифицированной нами методике. Результат разделения представлен на рисунке 6. На полученных электрофореграммах,

Таблица2. Стадии методики выделения и амплификации ДНК

лекарственного растительного сырья.

Рис. 7. Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов RAPD ДНК

листьев:1- монарды двойчатой - Monarda didyma L, 2- мяты перечной- Мentha

piperita L;

травы: 3- чабреца- Thymus serpillum L.), 4- мелиссы- Melissa officinalis L.;

цветков 5-манжетки обыкновенной – Alchemilla vulgaris L., 6-таволги вязолис-тной- Filipendula ulmaria Max.), 7-розы морщинистой - Rosa rugosa Thunb., mМ- маркер длины.

(рис. 6) четко видны различия наборов RAPD-фрагментов боярышников и обих видов череды, а RAPD-спектры для ДНК иван-чая розового и белого – а также

для двух рас горца почечуйного были идентичными, что говорит о их генети-ческой равноценности.

При изучении RAPD-спектров ДНК, выделенной из разных видов сухого сырья: цветков, листьев и травы растений, относящихся к разным семействам: Lamiaceae и Rosaceae: листья монарды, листья мяты перечной, трава чабреца, трава мелиссы; цветки манжетки, цветки таволги, лепестки шиповника на элек-трофореграмме наблюдались дискретные полосы, выявляющие межвидовые различия - фрагменты ДНК отличающиеся подвижностью (размерами) и их ко- личеством (рис. 7).

Проведённые нами исследования показали возможность применения данного метода для идентификации сырья лекарственных растений.

Нами разработаны оптимальные методики для RAPD-анализа 13 родов, от-носящихся к 5 семействам.

Применение секвенирования для изучения лекарственных растений

и лекарственного растительного сырья

Применение секвенирования для филогенетического анализа рода Anthylis L., также показало перспективность его использования для изучения лекарствен-ных растений народной медицины. Установлено, что род Anthylis L., проявляет себя как монофилетическая группа с высокими уровнями поддержки при ана-лизе как ядерных, так и хлоропластных маркеров. Изолированное положение на филогенетическом дереве вида Anthylis vulneraria L.,(рис. 8)

характеризуется рядом уникальных морфологических особенностей, как отде-льный подрод, что подтверждается данными об инделях: вставках из 6 п.н

(АТААСА) на участке petB-petD. Эти молекулярные маркеры (индели) также могут быть рекомендованы для идентификации лекарственного растительного сырья молекулярно-филогенетическими методами.

Изучение состава БАВ травы манжетки.

Нами было проведено изучение полифенольного комплекса: флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, танинов и аминокислотный состав видов рода Alche-milla L.Предварительное сравнительное изучение химического состава манже-ток: остролопастной, балтийской, изящной, собранных в июне 1990 года и в сентябре 1991 года в Истринском и Одинцовском районах Московской области показало сходство спектров поглощения спиртовых извлечений и сходство хро-матографического разделения: одинаковое количество зон адсорбции с Одина-ковыми R_f в различных системах растворителей. Далее исследование водных извлечений проводили с помощью метода ВЭЖХ. Идентификацию проводили по сопоставлению времен удерживания пиков соединений на хроматограмме с пиками стандартных образцов и совпадению УФ-спектров соединений с УФ-

Рис. 8. Филогенетическое дерево, построенное методом NJ

по участку ITS 1-2.

спектрами стандартных образцов. В водном извлечении были идентифицирова-

ны фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, коричная; флавоноиды – рутин, кверцетин, кемпферол (рис. 9). Определено, что в водном извлечении рутин составляет 50% и более суммы всех флавоноидов (табл.3).

Таким образом, в результате сравнительного химического изучения разных ви-дов манжетки, собранных в нескольких районах Московской и на севере Туль-ской области, нами была установлена сходность химического состава полифе-

Рис. 9. Хроматограмма водного извлечения травы манжетки:

1 - галловая кислота; 2 - хлорогеновая кислота; 3 - кофейная кислота;

4 - рутин; 5 - коричная кислота; 6 - кемпферол; 7 - кверцетин

Таблица 3. Содержание полифенолов в траве некоторых видов Alchemilla

----------------------------------------------------------------------------------------------------

! Содержание полифенолов, в %

Вид манжетки !галловой к-ты ! рутина ! гиперозида ! кверцетина

---------------------------------------------------------------------------------------------------

1. A.gracilis 9,5 28,7 14,2 7,8

2. A.gracilis 8,5 28,0 11,9 7,6

3. A.baltica 11,2 39,4 10,5 7,0

4. A.hirsuticaulis* 6,5 35,8 29,0 3,5

5. A.conglobata 10,1 32,3 19,3 5,5

6. A.gracilis 10,3 32,2 15,3 7,6

---------------------------------------------------------------------------------------------------

* A.hirsuticaulis попадает в сырьё как допустимая примесь, ее % - содержание невелико.

нольных соединений этих видов это послужило основанием для дальнейших исследований. Для более полного изучения полифенольного комплекса прово-дили фракционное изучение ацетонового извлечения травы манжетки, в кото-ром одна из фракций нами была идентифицирована как танин –агримониин.

Выделение агримониина. Нам удалось выделить из травы манжетки димер-ный эллаготанин – агримониин, который был идентифицирован прямым срав-нением спектра со спектрами известных образцов как агримониин, с помощью ¹Н ЯМР, ¹³C ЯМР и ПМР анализа. Полученные данные подтверждили пра-вомерность химической структуры агримониина – как одного из первых ди-мерных эллаготанинов, имеющих природное происхождение. Ранее японскими исследователями похожие соединения были выделены из некоторых растений также семейства розоцветные двух видов гравилата, репешка волосистого и эндемичной лапчатки [Okuda T., 1995].

Характеристики

Список файлов диссертации