Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

7. Результаты разработки алгоритма изучения перспективных видов лекарст-венных растений с использованием молекулярно-биологических и фармако-гностических методов.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на Российской национальной конференции «Формирование приорететов лекарст-венной политики (Москва, 28-29 июля 1995), на Первом международном сим-позиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования» (Пущино, 1-5 августа 1995), на научной конференции, посвя-щенной 50-летию ботанического сада ММА им.И.М. Сеченова (Москва, 1996), на Международном конгрессе по аналитической химии (Россия, 1997), на У и УШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва. 21-25 апреля 1998, и 2001), на научно-практической конференции «Традиционные методы лечения – основные направления и перспективы развития» (Москва,14-16 мая 1998), на интернациональном симпозиуме «Plant Evolution in Man-made Habitats” (Vena, August 10-15, 1998), на заседании Московского общества фито-терапевтов (Москва, ноябрь, 2000), на У1 Симпозиуме по фенольным соедине-ниям (Москва, 28-30 апреля 2004г),на научно-практической конференции «Со-временные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств» Москва, (30 мая 2006); на Международном конгрессе «Традиционная медицина 2007» (1-3марта 2007г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ в том числе в рецензируемых журналах - 9.

Объем и структура диссертации

Работа изложена на 236 страницах машинописного текста, содержит 77 ри-сунков, 38 таблиц и 3 приложения. Состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, 5 глав экспериментальных иссле-дований, общих выводов, списка литературы (250 источников, в том числе 118 на иностранных языках).

В обзоре литературы представлен анализ современного состояния проблемы изучения геномов растений, геносистематики, полиморфизма лекарственных растений показана перспективность использования молекулярно-биологичес-ких методов для решения сложных задач при изучении перспективных лекар-ственных растений, обладающих аберратными формами размножения. Охарактеризован агамно-половой комплекс Alchemilla vulgаris L.- как источ-ник ценного лекарственного сырья, его химический состав и перспективы при-менения.

Вторая глава посвящена описанию объектов исследования, методик и мето-дов анализа, использованных в работе.

В третьей главе приведены результаты применения RAPD-анализа при изу-чении самых распространённых видов рода Alchemilla, что позволило очертить круг производящих лекарственных растений для сырья – трава манжетки. Показана возможность практического применения полученных результатов по-зволивших предложить новый метод изучения лекарственных растений и ис-пользовать его для идентификации лекарственного растительного сырья.

В четвёртой главе показаны перспективы использования молекулярно-биоло-гических методов для изучения лекарственных растений: секвенирование ДНК растений (на примере рода Аnthylis L.) и RAPD-анализ различных видов сырья..

В пятой главе представлены результаты химического изучения наиболее распространенных видов рода Alchemilla и фракционное изучение полифено-лов травы манжетки, а также изучения её аминокислотного и элементного состава.

Шестая глава посвящена фамакогностическому изучению травы манжетки и практическому применению полученных результатов.

В седьмой главе представлены результаты оценки антиметастатической ак-тивности, острой и хронической токсичности водных извлечений травы ман-жетки.

В приложении представлены проекты нормативных документов по примене-нию RAPD-анализа для идентификации лекарственного растительного сырья, Иструкции по сбору и сушке травы манжетки-herba Alchemillaе, Фармакопей-ной статьи трава манжетки - herba Alchemillaе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Объекты и методы исследования.

В качестве объектов исследования были собраны следующие виды Alchemilla L.: манжетка голостебельная - Alchemilla glabricaulus Lindb.fil., манжетка ост-ролопастная - Аlchemilla acutiloba Opiz., манжетка балтийская - Alchemilla bal-tica G. Sam.ex Juz., манжетка шерстистая - Alchemilla hirsuticaulus Lindb.fil., манжетка близкая - Аlchemilla propinqua Lindb.fil.,манжетка горная - Alchemilla monticola Opiz., манжетка семиугольная - Alchemilla heptagona Juz., манжетка изящная - Alchemila gracilis Opiz., манжетка городчатая - Alchemilla subcrenata Buser., манжетка сарматская - Alchemilla sarmatica Juz.,манжетка полулунная-Alchemilla semilunaris Alech., манжетка волнистолистная – Alchemilla cymato-phylla Juz., манжетка шаровидно-скрученная –Alchemilla conglobata Lindb.fil (A.Juzepzukii Alеch.).

Определение дикорастущих видов проводили по ключам-определителям, разработанным С.В. Юзепчуком (1939г.) и В.Н.Тихомировым (1966 г.).

Выделение ДНК. ДНК выделяли с помощью модифицированной нами методи-ки Дж. Дрейпера (1989) с использованием экстракции цетилтриметиламмония бромидом. Концентрацию ДНК оценивали с помощью спектрофотометрии или электрофореза в агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием.

Выделение ДНК и сравнение геномов сначала проводили у хорошо определя-емых видов и близких родов:манжетка (Alchemilla gracilis Opiz.) и лапчатка (Po- tentilla erecta Hampe.),а также репешок (Agrimonia eupatoria L.), собранных в Истринском районе Московской области. Там же собирали цветки таволги (Fi-lipendula ulmaria Max.) и лепестки розы (Rosa rugosa Thunb., ceм. Rosaceae), траву горца почечуйного (Polygonum persicaria L., ceм. Polygonaceae), череды трёхраздельной (Bidens tripartitus L.) и поникшей (Bidens cernuus L. ceм. Astera-ceae).

Листья дуба черешчатого и красного (Quercus robur L. и Quercus rubra L. ceм. Fagaceae) и траву язвенника (Anthylis vulneraria L.,сем. Fabaceae) собирали в ботаническом саду МГУ им.М.В.Ломоносова. Образцы других видов рода Anthylis были любезно предоставлены нам из коллекций гербариев МW, MHA, LE и др.

Цветки иван-чая узколистного (Chamaenerium angustifolium (L.) Scop. и Ch. аngustifolium var. albiflorum Hausskn., ceм. Onagraceae.) обычные и белой рассы собирали в Одинцовском районе Московской области.

Листья мяты перечной (Мentha piperita L.) и монарды двойной (Monarda di-dyma L.),траву чабреца (Thymus serpillum L.) и мелиссы (Melissa officinalis L., сeм. Lamiaceae) собирали в ботаническом саду ГОУ ВПО ММА им.И.М. Сече-нова. Цветки боярышника собирали там же с боярышника кроваво-красного (Crataegus sanquinea Pall.), а цветки боярышника кавказского (Crataegus cau-casica C. Koch.,Cratz.et Mesp.) собирали на Черноморском Побережье в Гагрин-ском районе Абхазии. Для геномного анализа использовали листья перечислен-ных выше видов манжетки, собранных в разных районах Московской области.

Для построения филогении язвенника использовали молекулярные маркеры применяемые в геносистематике: внутренний транскрибируемый спейсер-inter-nal transcribed spacer(ITS1 и ITS2)участок 18S-5.8S-26S ядерного рибосомально-го цистрона-участок ДНК, отвечающий за единичную функцию (I.Alwres,2003); хлоропластный участок petB-petD относящийся к интронам II группы и состоя-щий из куска экзона petB, межгенного спейсера, экзона petD, интрона и куска экзона petD(C.Lohne, 2005);а также хлоропластный маркер экзон rps16 из груп-пы II интронов (M.Clegg,1993; B.Oxelman,1997).

Определение нуклеотидных последовательностей ДНК для язвенника прово-дили методом циклического секвенирования с использованием набора реаген-тов ABI Prism BigDye Terminator v. 3.1. с последующим анализом продуктов на

автоматическом секвенаторе ДНК ABI Prism 3100-Avant (Applied Biosystems) в Межинститутском Центре коллективного пользования «Геном» (Институт мо-лекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта).

Для изображения филогенетических деревьев использовали методы макси-мальной экономии, максимального правдоподобия и дистанционный.

Для исследований ценопопуляций манжетки была использована методика сбора и обработки материала, а также терминология, разработанная А.А.Урано-вым и его учениками (1973, 1975, 1980, 1987). Были рассмотрены разновозраст-ные популяции изучаемых видов манжетки. В качестве единицы счёта исполь-зовали, как элементарный источник фитогенного поля, особь.

При описании структуры и динамики ценопопуляций сбор сырья проводили в пределах одного участка ассоциации S=100 м² (10х10) внутри её контура, на трансектах (метод трансект Л.Б.Заугольновой, 1976). В ресурсоведческой рабо-те использовали методики разработанные А.И.Шретером (1966), и В.Б.Кувае-вым (1987). Урожайность сырья или плотность запаса рассчитывали на едини-цу площади (ц/га).

Фармакогностическое изучение сырья - трава манжетки: описание внешних признаков, микроскопический анализ, определение числовых показателей (вла-жность, зола общая и др.) проводили по фармакопейным методикам ГФ ХI, т.1 (1987) и т.2 (1990).

Водные извлечения из сырья готовили в соответствии с ГФ ХI, т.2(1990) в со-отношении 1:10. Извлечения 30% спиртом, 70% спиртом и ацетоном готовили в соотношении 1:10.

Изучение полифенольного состава проводили с помощью хроматографичес-ких методов. В работе была использована бумажная, тонкослойная, колоноч-ная хроматография и ВЭЖХ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили в соответст-вии с требованиями ГФ Х1 (1987г) и с использованием пакета статистических программ “Statistica for“.Для сравнительного изучения полифенольного, в част-ности флавоноидного состава настоев травы некоторых видов манжетки, наибо-лее часто встречающихся в естественных фитоценозах Подмосковья, был при-менён метод анализа – ВЭЖХ. Исследования проводили на хроматографе Per-kin Elmer, Diode Array, Detektor 235 C при длине волны 255 нм для флавонои-дов, и 280 нм - для фенолкарбоновых кислот. Колонка 150 х4,6 мм с размером частиц 3 мкм,сорбент гиперсил С 18; элюент ацетонитрил (АСN): вода (рН 3,2).

Компьютерную обработку полученных данных проводили по стандартной программе “Turbochrom “.

Определение содержания суммы флавоноидов проводили с помощью спект-рофотометра Beckman DU-65. Количественное определение суммы флавонои-дов проводили после модификации соответствующих фармакопейных методик спектрофотометрически.

Доклинические исследования настоя манжетки проводили на лабораторных животных: DВА₂; C57BI₆ ; гибриды BDF₁ и F₁; беспородные мыши SHK. В ис-следовании использованы перевиваемые опухоли: лимфолейкоз L1210, эпидер-моидная карцинома легкого Льюис(LLC) и саркома-37 асцитная и солидная.

Методы оценки острой токсичности и антиматастатической активности.

Изучение токсического действия настоя травы манжетки 1:10 и определение диапазона терапевтических доз на интактных животных проводили при опти-мальном пути введения вещества в организм в диапазоне доз от неэффективной до максимально переносимой (МПД). Использовали диапазон однократных или курсовых доз (при любой длительности курса). Для каждой дозы определялся максимальный эффект по одному из возможных критериев.

С помощью построения графика ″доза-эффект″ определяли ЕД20, ЕД50 и ЕД90 – расчетные дозы, вызывающие торможение роста опухоли (ТРО) на 20%, 50% и 90%, соответственно. Затем рассчитывали терапевтические индексы (ТИ20, ТИ50 или ТИ90) как соотношение соответствующей летальной и эффективной доз. ТИ является единственным показателем избирательности противоопухоле-вого действия, рекомендуемое значение ТИ50≥2. ТИ50 определяли по формуле: ТИ=ЛД50/ЕД50,где ЛД50 – доза, вызывающая гибель 50% здоровых животных.

Определяли оптимальные схемы терапии. Оценка эффективности терапии уста-навливали по увеличению продолжительности жизни, числу полных ремиссий или излечению.

Оценку эффективности лечения, противоопухолевого и антиметастатичес-кого эффекта определяли по торможению роста опухоли:

определяли 2-3 размера опухоли у каждого животного в группе, после чего вычисляли объем (V, мм3) опухоли по формуле: V=a•b•c или V=(a•b2)/2,

где a, b и с – длина, ширина и высота опухолевого узла. Затем вычисляли средний объем опухоли в группе Vср.

Степень торможения роста опухоли определяли по показателям ТРО и Т/С, вычисляемым по формулам: ТРО%=(Vконтроля-Vопыта)x100/Vконтроля,

Т/С%=Vопытаx100/Vконтроля,

где V- средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах, со-ответственно, на конкретный срок; Т – леченая группа; С – контрольная группа; Т/С – величина, обратная ТРО. Значимый противоопухолевый эффект должен сохраняться не менее 7 суток после окончания лечения.

Оценку антиметастатической активности проводили на карциноме легких Льюис, меланоме В-6 и Клаудмана, а также саркоме-37 характеризующихся вы-сокой интенсивностью ме­тастазирования и дающих макроскопические метаста-зы,доступные для каче­ственной и количественной оценки простыми способами. При оценке эффективности лечебных воздействий учитывали массу первичного опухолевого узла, частоту метастазирования опухоли (ЧМ),среднюю массу ме-тастазов в пересчете на 1 мышь, рассчитывали индексы ингибирования метаста -зирования (ИИМ) и торможения роста опухоли в процентах (ТРО).

Характеристики

Список файлов диссертации