Фармакогностическое изучение лекарственных растений с использованием молекулярно-биологических методов (1097487), страница 3

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 3)

Частота метастазирования опухоли – процент животных с метастазами по отно-шению к общему количеству животных в группе. В случае лимфогенного мета-стазирования подсчитывали массу метастазов и среднее значение этого показа-теля в группе. В зависимости от количества и размера метастатических узлов в легочной ткани определяли степень поражения легких.

Индекс ингибирования процесса метастазирования (ИИМ) рассчитывали по формуле: ИИМ = [(А х Вк) – (А х В)] х 100%/ Ак х Вк,

где Ак и А – частота метастазирования в легкие у мышей контрольной и опыт-ной групп; Вк и В – среднее число метастазов в легких в контрольной и опыт-ной группах.

Торможение метастазирования по средней массе легких (ТРМ%):

ТРО%=(сред. m легких контроля-сред.m легких опыта) х100/Vконтроля

Изучение геномов видов рода манжетка (как модельного)RAPD-методом

Для установления молекулярно-генетического родства между апогамными видами и популяциями манжетки обыкновенной был применён получивший широкое распространение в последнее десятилетие прошлого века метод поли-меразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами со случайной произвольной по-следовательностью – RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) – или AP (Arbitrary Primed) – анализ (Welsh J., 1990; Williams J.G.K, 1990), который ус-пешно используется для оценки степени cходства геномов близкородственных организмов, относящихся к самым разным таксономическим группам.

На первом этапе нами была предпринята попытка сравнительного изучения геномов нескольких хорошо определяемых в природе видов: м.балтийской, м. изящной и м.городчатой. Первые две отнесены одними авторами, а последние две – другими авторами - к манжетке обыкновенной; для сравнения, в качестве устойчивого вида, не образующего агамный комплекс, использовали лапчатку прямостоячую. Для выделения сумарной ДНК использовали методику, предло-женную Дж.Дрейпером (1989) и случайные праймеры П₁₇ и П₂₀. Перед этим на-ми экспериментально были подобраны: реакционная смесь (объем полимеразы, количество магния хлорида, число, количество и состав праймеров: режим ПЦР и количество циклов. Для“DNA Thermal Cycler”“Perkin Elmer Cetus” (USA) был подобран следующий режим:

денатурация 94º C – 2 мин } 94ºC – 1 мин }

отжиг 25ºC - 2 мин } 2 цикла и 55ºC - 1 мин } 40 циклов

элонгация 70º C - 2 мин } 72ºC – 1 мин }

В качестве контроля ставили пробу без ДНК и пробу без праймера. Продук-ты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле в трис-боратном буфере и фотографировали на пленку “Микрат” в проходящем УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

В результате нами было установлено, что ДНК лапчатки прямостоячей отли-чается от ДНК манжеток по следующим молекулярным признакам: при одина-ковых условиях амплификации у манжетки стабильно амплифицируется набор фрагментов, отличающихся молекулярной массой. Реакция хорошо воспроизво-дится в стандартных условия в диапазоне концентраций ДНК от 10 до 20 нг. Введение в реакционную смесь второго праймера увеличивает число амплифи-цированных фрагментов ДНК для манжетки и изменяет их подвижность для фрагментов ДНК лапчатки.

Сравнение продуктов амплификации ДНК репешка европейского,азиатского, лапчаток гусиной,ползучей и манжеток показало наличие отличающихся набо-ров полос с различной подвижностью, что позволило предположить возмож-ность дальнейшего использования этого метода для идентификации видов рода манжетка.

Далее брали небольшое количество хорошо определяемых видов из опреде-лённых мест обитаний: манжетка балтийская, собранная в Истринском районе и манжетка балтийская, собранная в парке ботанического сада ММА им. И.М. Сеченова. Для них выявлены значительные отличия, а именно, наличие у пер-вой - набора из восьми фрагментов амплифицированной ДНК,а у второй – то-лько из пяти, причем, нижние две полосы, имеющие длину около 500 нуклео-тидов,(определённую относительно маркёра _Hind-lll) менее четкие. При этом манжетки, собранные в одном фитоценозе (Истринский район), изящная и горо-дчатая, хорошо различающиеся по внешним признакам, проявляли явное сход-ство наборов RAPD–фрагментов по шесть одинаковых полос. Эти виды объеди-нены С.К.Черепановым (1981) в одну группу - манжетка обыкновенная.

Набор фрагментов, амплифицированных для манжетки полулунной, из этого же фитоценоза и не относящейся вообще к манжетке обыкновенной, также как для манжетки балтийской представлен пятью полосами, но они отличаются по длине. Манжетка Линдберга, также как и полулунная, не относящаяся к группе манжетка обыкновенная и собранная в Щёлковском районе, давала на электро-фореграмме четыре фрагмента, из них последний – четвёртый более короткий, соответствующий фрагменту маркёра _Hind-lll длиной менее 500 пн, характерен только для этого вида.

Таким образом, проведённый RAPD-анализ ДНК манжеток дал обнадёжи-вающие результаты, показавшие возможность его использования для иденти-фикации представителей сложных агамных комплексов.

На следующем этапе для исследования объектами служили апогамные виды Alchemilla vulgaris L.s.ampliss., собранные в период цветения в Московской об-ласти – A.baltica (1 – Бот.сад ММА им И.М.Сеченова, II – Истринский район), A.gracilis, A.subcrenata, A.hirsuticaulis ( I – Щёлковский район, II – Истринский район, К– Казахстан, предгорья Ала-тау, интродуцированая в Бот.саду ММА), А. propinqua, A.lindbtrgiana и A.semilunaris. Собранные листья замораживали и хранили при -20ºС до выделения ДНК.

Полимеразная цепная реакция.

Для амплификации использовали 10-ти членные олигонуклеотидные прай-меры П₁-П₄ с произвольной последовательностью:

П₁ – 5´- СТСАССGTCC-3´, П₂– 5´- ACGGTACCAG-3´,

П₃ – 5´- GATGACCGCC-3´, П₄ – 5´- AGGCGGGAAC-3´.

М 1 2 3 4 5

Рис. 1. Электрофореграмма в 2% агарозном геле RAPD-

фрагментов ДНК A.hisuticaulis с разными праймерами (П)

М – маркёр длины – перевар ДНК фага λ рестриктазой PstI.

1 – П₁ ; 2 - П ₂; 3 - П₃ ; 4 - П ₄; 5 - П₄

Реакционная смесь объёмом 20 мкл содержала 1 ед. Taq полимеразы “Prome-ga”, в буферном растворе, предлагаемом фирмой, по 100 мкМ dATP, dTTP, dCTP, dGTP, 1мкМ праймера, 4 mM MgCl₂ и 10-20 нг ДНК. ДНК амплифици-ровали в течение 36 циклов в програмируемом термостате “Циклотемп” (СТМ, Москва) в режиме: денатурация – 1 мин 94ºС, отжиг – 1 мин 37ºС, элонгация – 2 мин 72ºС. Продукты реакции (около 10 мкл из реакционной смеси) разделяли электрофорезом в 2%-ном агарозном геле в трис-боратном буфере и фотогра-фировали на плёнку “Микрат” в проходящем УФ-свете (305 нм) после окра-шивания бромистым этидием.

Компьютерный ввод изображений и их обработка проведены с использова-нием видеоденситометра и програмных продуктов фирмы “itti” (USA). Построение фенограммы осуществлено невзвешенным парно-групповым мето-дом с арифметическим усреднением (UPGMA) с использованием пакета про-грамм “Восторг” (ИЦИГ РАН, Новосибирск).

Результаты и обсуждение. Количество продуктов амплификации, выявляе-мых как отдельные полосы после электрофореза, в реакции при использовании конкретного праймера с определённой последовательностью нуклеотидов зави-сит от количества сайтов связывания праймера, т.е. участков последовательнос-ти ДНК, комплементарных данному праймеру в обеих цепях ДНК исследуемо-го генома и/или от их относительного сродства. Поэтому RAPD-паттерны для каждого конкретного праймера будут состоять из различного количества полос.

Кроме того, на количество и интенсивность полос оказывают влияние усло-вия проведения реакции амплификации-концентрация и степень очистки ДНК, температура отжига праймера, концентрация MgCl₂, число циклов амплифика-ции. Для каждого праймера необходимо было подобрать оптимальные усло-вия, при которых амплификация происходит эффективно и даёт воспроизводи-мые результаты. Последующее строгое соблюдение этих условий проведения реакции гарантировало надежность полученных результатов.

Четыре имевшиеся в нашем распоряжении праймера П₁ – П₄ были пред-варительно проверены в реакции амплификации с A.hirsuticaulis (рис. 1). Установлено,что все праймеры активны в реакции амплификации и служат за-травкой для синтеза наборов специфических фрагментов ДНК. Количество и длина амплифицированных с каждого праймера фрагментов, как и следовало ожидать, неодинаковы. В последующих опытах был использован праймер П₂, приводящий к RAPD-спектру с наибольшим количеством полос (рис. 1).

Для оптимизации условий реакции было исследовано влияние изменения температуры отжига праймера, концентрации MgCl₂ и концентрации ДНК на набор продуктов реакции. Установлено, что результаты хорошо воспроизводят-ся в диапазоне температуры отжига от 30 до 37ºС и концентрации MgCl₂ 2,5 – 4,0 мМ, а также при разведении исходных растворов ДНК в отношениях от

М 1 2 3 4 5 М 6 7 8 9 10 10 М

Рис. 2. Электрофореграмма в 2% агарозном геле (Sigma)

RAPD-фрагментов ДНК

1.- A.semilunaris, 2.- A.gracilis, 3.- A.baltica (1), 4.- A.baltica (П),

5.- A.subcrenata, 6.- A.propinqua, 7.- A.lindbergiana, 8.- A.hisuticaulis (1),

9.- A.hisuticaulis (K), 10.- A.hirsuticaulis (П) c праймером П₂

М – маркёр длины – перевар ДНК фага λ рестриктазой PstI.

1:10 до 1:100. Для последующих опытов были использованы разведения 1:50, что соответствует содержанию 10-20 нг ДНК в реакционной смеси.

Разделение амплифицированных фрагментов ДНК апогамных видов популя-ций Alchеmilla при электрофорезе в агарозном геле (рис.2),с последующим сканированием и математической обработкой полученных результатов с помо- щью компьтерных программ позволило установить, что исследуемые апогам-ные виды и популяции характеризуются специфическими RAPD-спектрами. Различия касаются как наличия/отсутствия полос одинакового размера у раз-ных видов, так и изменения относительной интенсивности некотоых полос.

Рис.3. Распределение амплифицированных фрагментов ДНК разной

молекулярной массы у исследованных видов манжетки

(обозначения см. рис.2).

На рисунке 3 показано присутствие амплифицированных фрагментов ДНК с указанием их размеров, а в таблице 1 – матрица состояний бинарного признака наличия/отсутствия (1/0) полос с одинаковой электрофоретической подвижнос-тью в RAPD – спектрах изученных растений. Минорные полосы слабо выявля-ющиеся на электрофореграммах рассматривались как отсутствующие, и им приписывалось значение 0.

По этим данным рассчитана матрица различий между видами и популяциями манжетки,по которой построена фенограмма (рис.4).Полученные данные свиде-тельствуют,что как апогамные A.vulgaris L.Ampliss.,так и популяции одного ви-да различаются по RAPD-спектрам, при этом диапазоны уровней сходства меж-ду популяциями и видами могут перекрываться.

Обращает внимание, что две популяции A.hirsuticaulis из Московской облас-ти гораздо более сходны между собой, чем с популяцией того же вида из Казах-

стана.Какого-либо соответствия характера кластеризации на фенограмме со схемами таксономии Alchemilla В.Ротмалера (1936) и С.В. Юзепчука (1941) не прослеживается.

Таким образом, полученные данные результов RAPD – анализа свидетельст-

вуют об отсутствии различий уровней внутри- и межвидовой генотипической изменчивости в группе A.vulgaris.Определение степени изменчивости подмос-ковных видов рода манжетка показало, что из всех видов только A.gracilis и A.baltica ведут себя как монофилетические групппы, A.glaucescens и A.hirsuti- caulis вместе также образуют монофилетическую группу. Все остальные виды не проявляют себя как монофилетические.

A.glaucescens, A.hirsuticaulis, A.monticola и A.sarmatica вместе образуют мо-нофилетическую группу. Все четыре вида относятся к секции Plicatae, согласно

Характеристики

Список файлов диссертации