Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств (1091937), страница 2
Текст из файла (страница 2)
В связис этим актуальным направлением является исследование взаимодействий различныхсинтетических молекул с нуклеиновыми кислотами для управления процессамитранскрипции РНК (антиген стратегия) и экспрессии белка (антисмысловая стратегия).Одними из таких молекул, которые показали хорошие результаты in vitro, являютсяполиамидные миметики нуклеиновых кислот. Данный тип миметиков сочетает в своейструктуре полиамидный скелет (с чередованием амидной связи и её восстановленнойформой) и нуклеиновые основания, присоединенные к скелету через карбоксиметильныйлинкер [1].BBONHBO5ON HNnaeg-ПНК N 4XO(CH2)nO4 N 2N HO2n(H2C)X5nn-ПНК-ПНКB=T,C,A,GX=-OH;-COO-;-SH;-NH3+;- HN+NH2NH2Рисунок 1. Структура ПНК.«Классические»aeg-ПНК(рис.1),состоящиеизповторяющихсяN-2-аминоэтильных единиц (aeg) показывали низкую растворимость и слабую проникающаяспособность таких соединений в in vivo экспериментах.
Улучшение данных свойств былодостигнута за счет работы с различными модификациями ПНК. Недавние разработкипоказали, что наличие хирального центра, его конфигурация (R или S) и егоместоположение в структуре мономера (α(2)- или γ(5)-положение) (рис. 1) влияют нааффинность олигомеров ПНК к ОН (ОДН) через преорганизацию их вторичной структуры[2]. В то же время введение различных функциональных групп, в составе боковыхрадикалов, может улучшать биодоступность таких соединений, например, положительнозаряженные ПНК на основе аргинина [3, 4] могут взаимодействовать с мембранойэукариотических клеток, посредством эндоцитоза проходить через нее и локализоваться вядре эукариотических клеток, что является благоприятным фактором для антиген терапии.В целом, модификации ПНК способны стать новым объектом исследования какмедицинской химии, так и молекулярной биологии, и занять значимое место на рынке6высоких технологий, в случае разработки эффективной методологии получениямодифицированных мономеров и олигомеризации их на полимерном носителе,обеспечивающей высокую синтетическую доступность этих соединений.На кафедре биотехнологии и бионанотехнологии Московского государственногоуниверситета тонких химических технологий им.
М.В. Ломоносова проводятсяфундаментальные исследования по созданию хиральных ПНК на основе L-Ala идикарбоновыхаминокислот.Исследованиепоследнихпредполагаетналичиеотрицательного заряда, представленного карбоксильной группой, что позволит улучшитьрастворимость и использовать катионные носители для доставки ПНК через мембрану вцитоплазму, что разрешает главные сложности использования ПНК. Ранее были полученыпиримидинсодержащие мономеры α- и γ-ОЗ ПНК (рис.
1) и аденинсодержащий мономерα-ОЗ ПНК на основе L-Glu [5, 6]. Была продемонстрирована гибридизационнаяспособность гомотиминовых ОЗ ПНК к образованию комплексов с комплементарнойДНК-мишенью [5], а также предложены методы по определению оптической чистотымономеров на основе L-Ala [7]. В связи с этим актуальной является задача препаративногополучения пуриновых мономеров ОЗ ПНК (гуанинсодержащих, в случае α-ПНК и аденин, гуанинсодержащих, в случае γ-ПНК) для возможности разработки протокола синтезаолигомеров, содержащих все четыре нуклеиновых основания в своей структуре, с цельюдальнейшего определения эффективности ОЗ ПНК при взаимодействии с ОН (ОДН).7Литературный обзорРазработка антиген- и антисмысловых технологий для генной терапии и леченияопухолевых заболеваний открыло новую синтетическую область в медицинской химии –созданиемиметиковнуклеиновыхкислот.Такиемиметикисвязываютсясоспецифичными последовательностями нуклеотидов в ДНК (РНК)-мишенях, препятствуялибо процессу транскрипции, либо процессу трансляции.
К настоящему временинасчитывается уже три поколения миметиков нуклеиновых кислот, каждое из которыхимеет свои преимущества и недостатки [8, 9].Для препятствования экспрессии вредоносного гена, синтез РНК в клетках можетбыть подавлен при помощи следующих механизмов:А) Связывание с ДНК и блокирование процесса транскрипции (антиген стратегия).Б) Гибридизация с РНК и блокирование процесса трансляции (антисмысловаятехнология).Причем при связывании с РНК антисмысловой олигомер может быть «преградой»для рибосомы или изменять процесс сплайсинга, либо вызывать деградацию РНКмишени. Деградация РНК-мишени происходит при действии РНКаз на одно- идвухцепочечные РНК-мишени.
Известно, что РНКазы Н – это ферменты, которыерасщепляют РНК в составе РНК-ДНК дуплекса. Кроме того, малые интерферирующиеРНК участвующие в процессе РНК-интерференции, образуя дуплекс с РНК-мишенью,способны вызывать действие РНКаз III, которые приводят к деградации двухцепочечныхРНК [10, 11].На эффективность действия миметиков и аналогов нуклеиновых кислот всоматических клетках могут оказывать влияние природные антисмысловые транскрипты(ПАТ), которые были найдены в эукариотических клетках. Антисмысловые транскриптымогут кодировать различные белки или оставаться некодирующими молекулами.Некодирующие антисмысловые транскрипты регулируют генную экспрессию наразличных этапах в процессе переноса информации от транскрипции до трансляции.Важным является образование двухцепочечной РНК через связывание антисмысловойпоследовательности со смысловой РНК.
Антисмысловые транскрипты могут возникатьпритранскрипцииблизкорасположенныхобеихцепейгенов,гена.Вкодирующихдругомслучае,разныебелки,прии,транскрипциичитающихсявантипараллельной ориентации, может образовываться антисмысловой транскрипт одногогена к другому. Около 5-10% генома человека могут иметь антисмысловые транскрипты.Таким образом, антисмысловые транскрипты могут быть результатом, по крайней мере,двух процессов и играть важную роль в регуляции генов и фенотипов организмов через8различные механизмы.
Если антисмысловой транскрипт был гибридизован к части РНКмишени, то такой участок будет менее доступным для антисмысловой терапии. Такжелюбое влияние антисмысловых транскриптов на регуляцию промежуточного метаболизмаРНК-мишеней может повлиять на механизмы действия антисмысловых препаратов,которые конструируются для того, чтобы связываться с РНК [10].В зависимости от соотношения между мономерными звеньями модифицированныхолигонуклеотидов с природными мононуклеотидами, модифицированные олигомерыразличают на 5 категорий: миксмеры (1), гэпмеры (2), хедмеры (3), тэйлмеры (4) иполностью модифицированные миметики (5) (рис.
2). В миксмерах видоизмененныеостатки распределены по всей длине олигонуклеотида, в то время как в гэпмере двасегмента миметиков на концах олигомера разделены последовательностью другихнуклеотидных аналогов. В хэдмере миметикоподобные мономеры позиционируются на 5'конце, тогда как у тэйлмеров на 3'-конце. Полностью модифицированные миметики ианалоги состоят только из синтетически модифицированных мономеров [12].Рисунок 2. Виды аналогов и миметиков нуклеиновых кислот в зависимости от ихмономерного состава [12].В качестве количественной характеристики миметиков нуклеиновых кислот частоиспользуют минимальную инактивирующую длину (МИД).
Данная величина может бытьопределена, как самая короткая длина олигонуклеотида заданной структуры, котораяэффективно связывает комплементарную мишень при наименьших концентрациях вцитозоль-ядерном отделе обработанных клеток. Измеренные значения МИД дляконкретных структурных типов миметиков позволяют составить функцию от длиныпоследовательности,илисодержанияG+Cиконцентрациитестируемыхолигонуклеотидов. Для высокой аффинности (определяемой значением температурыплавлениякомплексаселективностимодифицированногосвязываниясОН(ОДН)олигонуклеотидасДНК(РНК))и(определяемойкак∆Tmкомплексамодифицированного олигонуклеотида с ДНК (РНК) и дуплекса содержащего мисматч) в9сложных системах значения МИД должны быть достаточно большие, такие чтобыолигомеры имели лишь небольшую возможность для инактивирующего воздействия снецелевымиРНК.Такжедлядостижениявысокойэффективности,длинамодифицированных олигонуклеотидов должна быть равной или быть чуть длиннее, чем ееМИД [13].Для конструирования терапевтических препаратов на основе различных типовмодифицированных олигомеров необходимо учитывать все преимущества и недостаткиранееразработанныхрядааналогов.Поэтомувданномобзорепредставленахарактеристика аналогов и миметиков нуклеиновых кислот различных поколений,модифицированных по сахаро-фосфатному остову, а также представлено сравнение ихпреимуществ и недостатков.МетилфосфонатыОбщая характеристикаМетилфосфонаты (рис.
3) являются одними из первых синтетических аналоговолигонуклеотидов, в данных молекулах неэтерифицированная фосфатная гидроксильнаягруппа заменена на метильную группу [9]. Метилфосфонаты могут быть как аналогамиОДН (R= -H, рис. 3), так и аналогами 2'-ОМе-олигорибонуклеотидов (R= -OCH3, рис. 3), вэтом случае метифосфонаты содержат остатки 2'-О-метилрибозы [14].BBRO(5`-)OBRMeOO POOMeO POOROO(3`-)R=-H, -OCH3Рисунок 3. Структура метилфосфонатов.Метилфосфонаты являются хиральными молекулами по атому фосфора, такимобразом, стандартная процедура твердофазного синтеза (ТФС) приводит к образованиюсмеси диастереомеров [15].Синтез метилфосфонатовСинтез метилфосфонатов заключается в олигомеризации модифицированныхрибонуклеотидов или дезоксирибонуклеотидов, либо в растворе, либо на твердой фазе.Дляполученияметилфосфонатовврастворе(схема1)частоиспользуютсядиметокситритилзащищенные мононуклеотиды 6, в качестве агента для создания10метилфосфонатной связи используется метил-бис-О,О-[1-бензотриазолил]фосфонат 7.Конденсацию между следующим нуклеотидом с защищенной 3'-гидроксильной группой 9и метилфосфонатом 8 проводят в присутствии N-метилимидазола (N-MeIm).
Послеудаления защитной группы с 3'-гидроксильной группы конечного мономерного звена,происходит повторение предыдущих этапов до достижения заданной последовательностиолигонуклеотида [16].Схема 1. Синтез метилфосфонатов в растворе [15].DMTrOCH3TBO PDMTrOOOBTOBBODMTrOBO7OHOOHO6PON-MeIm8 OBTOBOCH3O P CH3BOOR 910ORR=-C(O)CH2CH2COCH3Но чаще всего метилфосфонатные последовательности получают, используятвердофазный синтез на полимерном носителе. В твердофазном синтезе метилфосфонатовиспользуют метилфосфоамидитные синтоны 11, 12 (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
