Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств (1091937), страница 8
Текст из файла (страница 8)
создали пептоидные ОЗ ПНК, что должно былоуменьшитьвлияниеводородныхсвязей(исключитьвозможностьобразованияциклической формы ПНК рис. 16) на стабильность дуплексов ПНК-ДНК [82]. Онисинтезировалипептоидныемономеры,вкоторыхγ-атомводородазамещалсякарбоксиметильным линкером, а нуклеиновое основание было присоединено кпептидному остову при помощи этильного линкера, тем самым увеличивая гибкостьданной молекулы (рис. 18А).
Данные изменения в структуре ПНК должны были не толькоувеличитьрастворимостьтакихсоединений,ноиповыситьстепеньсвободынуклеинового основания при взаимодействии с ОН (ОДН). Но, в действительности,данные структуры не образовывали никаких комплексов с ОН (ОДН).Поэтому в 2012 этой же группой ученых был опубликован синтез ПНК,содержащих в своей структуре мономер с алкильно-карбоксильным заместителем при γNH атоме псевдопептидного фрагмента (рис. 18Б) [83].
Полученные олигомеры (HGTхAGATхCACTх-(Gly)NH2, где х-модифицированный γ-NH ОЗ мономер) показываликомплексообразование с ДНК, уступающее aeg-ПНК, причем температура плавлениядуплексов уменьшалась при увеличении количества γ-NH отрицательно-заряженныхмономеров в цепи. В целом, была показана возможность создания ОЗ ПНК с замещениемγ-NH-сайта молекулы ПНК.В конце 90-ых годов группой российских ученых под руководством Ефимова В.А.,были разработаны отрицательно-заряженные ПНК, имеющие в своей структурефосфонатные группы. Первыми были описаны фосфонатные рПНК (рис. 19), которые засчет заряженных групп показывали высокую растворимость, но значения Т m длякомплексов с ДНК и РНК молекулами оказались более низкими по отношению к aeg-ПНК[84].39BBOOOP OONNHONNHРисунок 19.
Структура фосфонатных ПНК [84].Поэтому для улучшения физико-химических параметров связывания с ОН (ОДН)были синтезированы гибридные синтоны из рПНК и aeg-ПНК (рис. 20). Такие молекулыпоказывали более высокие показатели аффинности к ОН (ОДН) по сравнению с рПНК,причем гомопиримидиновые ПНК-рПНК химеры при взаимодействии с оцДНК и РНКобразовывали триплексные структуры [84].BBBOONHNOP OOOONNNHOPOOРисунок 20. Структуры химерных молекул ПНК-рПНК [84].Продолжение исследования отрицательно-заряженных ПНК привело к синтезугидроксипролиновых ПНК (HypНК), а также их гибридов с рПНК (рис. 21) [85].
Оба видаОЗ ПНК показывали высокую растворимость в водных растворах и устойчивость кдействию протеаз и нуклеаз.BBOOPOONOOOP OONBBOOONPOOONHNOP OOРисунок 21. Структуры HypНК их химеров с рПНК [85].Изучение гибридизационных свойств таких олигомеров показало, что значение Тmкомплекса HypНК-рПНК с РНК (длина - 18 н. о.) сопоставимо с Тm комплекса морфолиноолигомера длиной 25 н. о. с РНК.
Также HypНК-рПНК олигомеры могли в низкихконцентрациях проникать через клеточную мембрану, локализуясь в цитоплазме, причемдобавлениектакимгибридныммолекуламнековалетно-связанногобелка,последовательностью – KETWFETWFTEWSQPKKKRKV, повышало биодоступность40таких соединений, что позволило провести ряд экспериментов in vivo, показывающих, чтоданные молекулы могут быть хорошими агентами в антисмысловой терапии [85].Основываясь на работах российских ученых, Nielsen et al. разработали ПНК,имеющие в своемсоставефосфонатпроизводные аминоксилотдляувеличениябиодоступности ахиральных молекул [86].
В ходе работы к молекулам aeg-ПНК былиприсоединены либо глутамин фосфонатные, либо лизин бис-фосфонатные молекулы (рис.22). Причем присоединение таких структур к ПНК скелету практически никак неотражалось на гибридизационных свойствах таких молекул при сравнении с aeg-ПНК. Втожевремяконъюгацияскатионнымилипидамиприводилакповышениюбиодоступности aeg-ПНК, что еще раз демонстрировало возможность использования дляОЗ ПНК – систем доставки в клетки, разработанных для ДНК (РНК).OHNOHNПНКПНК-ONHHNOa-POбO-OOP OOOP OOРисунок 22.
Структуры глутамин фосфонатных (a) и лизин бис-фосфонатныхаминокислот (б), соединенных с aegПНК [86].Недавно было показано, что введение отрицательного заряда за счет сульфатных(рис. 23А) [87] или карбоксильных групп (рис. 23Б) [88] в γ-положение остова,способствует повышению аффинности к ОН (ОДН) за счет преорганизации структурытаких олигомеров.
Также γ-карбоксильные ПНК показали более высокие показателисвязывания с РНК при физиологических рН, чем aeg-ПНК и положительно-заряженныеПНК, что является важным фактором для биологических испытаний таких соединений.TSO3OOANHONT-OOCБNHOONРисунок 23. Структура сульфатных ПНК (А) [87] и карбоксильных ПНК (Б) [88].41Фармакокинетические исследования были проведены с немодифицированнымиaeg-ПНК олигомерами, которые показали, что биодоступность aeg-ПНК in vivo крайнеограничена из-за очень быстрого выведения (t1/2<30 мин) почками.
Такой выводподтверждается экспериментом [89, 90], где был использован трансгенетический GFPбелок мыши, причем GFP может быть активирован антисмысловым исправлениемсплайсинга, и, было оценено антисмысловое воздействие aeg-ПНК, МОЕ-фосфоротиоат(рис.7)иморфолиноолигомеровнаданныймеханизм.Результатыяснопродемонстрировали, что никакого взаимодействия не оказалось при использовании aegПНК, в тоже время aeg-ПНК, конъюгированные с четырьмя лизиновыми остаткамипоказывализначительноеантисмысловоедействие(присравнениисМОЕ-фосфоротиоатами и морфолино) в печени, мышцах и сердце, указывая на то, чтоконъюгация с пептидами может положительно влиять на биодоступность aeg-ПНК.Используя различные подходы биодоступность в отдельные органы была улучшена припомощи нацеливания ПНК к рецепторам, которые локализуются на конкретной клетке.Былопоказано,что(N-ацетилгалактозамин)-модифицированныеaeg-ПНК[91]концентрируются в печени из-за присутствия гликопротеиновых рецепторов, хотяостается неясным насколько aeg-ПНК доступны для нацеливания на мишень внутригепатоцитов или Купфер клеток печени.
Более вероятно, что в этом случае большинствоaeg-ПНК будут помещены в эндосомы из-за рецептор-вызванного проникновения [89].aeg-ПНКимеютразнообразныйнаборприменений,которыйвключаетингибирование генной экспрессии [92], различные методы диагностики на уровнеДНК/РНК и сенсорные технологии [93, 94], определение полиморфизма единичногонуклеотида (SNP) [95]. Молекулярное конструирование ПНК привело к синтезу аналогов"следующего поколения", которые обещают улучшить работу ПНК во многихсуществующих отраслях науки.ЗаключениеКроме вышеописанных миметиков существуют еще ряд различных искусственносозданных олигомеров подобных нуклеиновым кислотам.
Постоянно идет процесс поисканаиболее подходящих структур для использования в качестве инструментов вмолекулярной биологии и антисмысловой терапии. За последние 20 лет было предложенобольшое разнообразие миметиков, некоторые из которых применяются в клиническихиспытаниях, некоторые используются в качестве сенсорных технологий по определениюмутаций в геноме.42Как видно из вышеописанного материала, каждый класс аналогов и миметиков ОН(ОДН) обладает своими преимуществами и недостатками (табл. 6), в тоже времястоимость ДНК аналогов (метилфосфонаты, фосфотиоаты, ЗНК) значительно вышестоимостимиметкиовОН(ОДН)(МО,дезоксирибонуклеозидов,чтоиграетнемаловажнуюaeg-ПНК),ввидурольвдорогивизныпроизовдствеолигонуклеотидов и олигомеров для терапии. ПНК, показывая хорошую аффинность иселективность связывания с ОН (ОДН), также обладают высокой степенью вариативностиструктуры, за счет чего могут быть решены проблемы, связанные с растворимостью ибиодоступностью.
Тем самым можно сказать, что ПНК выглядят довольно перспективнымклассом миметиков ОН (ОДН).ности структурыСтепень вариатив-БиодоступностьсредняяфосфотиоатыНизкаявысокая+8высокаясредняяЗНКВысокаявысокая-н. д.высокаявысокаяВысокаявысокая-15низкаясредняяВысокаянизкая-10низкаявысокаяМорфолиноолигомерыaeg-ПНКРНКазы НвысокаяСпособностьн. д.Растворимость-натыпротеазамсредняяМетилфосфо-нуклеазам иВысокаяУстойчивость кМИДвызывать действиеТаблица 6. Суммарная характерстика аналогов и миметиков ОН (ОДН).Крайне важно продолжать работу по поиску новых соединений, которые будутспособны связываться с нуклеиновыми кислотами последовательно-специфичнымспособом и иметь улучшенную растворимость и биодоступность. Перспективнымиобъектами среди таких соединений выглядят ПНК, содержащие в своей структуреотрицательный заряд.43Теоретическая часть1Возрастающаяусовершенствованияпотребностьметодовсовременныхантисмысловоймедицинскихтерапиитехнологийтребуетсозданиявысокоэффективных препаратов, которые бы воздействовали на различные процессыметаболизма ДНК (РНК).
Полиамидные миметики нуклеиновых кислот могут стать темисоединениями,которыеспособныпреодолетьпрепятствия,стоящиепередиспользованием миметиков первых поколений. Ранее было показано, что введениеотрицательного заряда в структуру ПНК за счет фосфонатных групп несильно искажаетстабильность комплексов, образованных с ОН (ОДН), а также способствует увеличениюбиодоступности таких соединений при помощи их конъюгирования с липиднымикатионными носителями [85, 86]. Введение же заместителя в 2(α) или 5(γ) (рис. 1)положение остова ПНК приводит к образованию хирального центра в молекуле ПНК испособствует преорганизации ее структуры, что улучшает гибридизационные свойстватакихПНК[4].Учитываявышесказанное,перспективнымявляетсясозданиеотрицательно-заряженных ПНК (ОЗ ПНК) (рис. 1), которые являются новым поколениемполиамидных миметиков.COOOBBO5ON H4 N 2N H 5 -ПНК N 4O2n-ПНКCOO-nB=T,C,A,GРисунок 1.
Структура хиральных ОЗ ПНК.Также в настоящее время повышенное внимание уделяется исследованиювзаимодействия миметиков нуклеиновых кислот с ДНК (РНК) с образованием Gквадруплексов [96] с целью определения регуляторной функции данных элементов впроцессе экспрессии гена, для полноценного изучения таких взаимодействий, необходимоконструирование ПНК с большим содержанием гуаниновых остатков, что требуетразработки синтеза гуанинсодержащих мономеров ОЗ ПНК.1Нумерация схем, рисунков и соединений отлична от литературного обзора44Синтез пуринсодержащих мономеров ПНК.Синтез защищенных гетероциклических основанийРанее было показано, что для синтеза мономеров ОЗ ПНК, использованиестратегии с получением карбоксиметилированных производных (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
