Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств (1091937), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Данные о химическихсдвигах ключевых сигналов представлены в таблице 2.Таблица2.Химическиесдвигиключевыхсигналовдляопределениярегиоселективности реакций алкилирования.Номер в-ваС4С5С8Линкер (Л)H23a--7.695.13-5.03δ м.д.25b--8.28-8.185.52-5.47 и 5.37-5.3326b--8.19-8.015.72-5.67 и 4.89-4.8323a154.1114.1140.045.125b152.3122.2144.944.026b153.5116.8143.642.51С13δ м.д.Фрагменты двумерных НМВС-спектров мономеров представлены на рисунках 3-5,с указанием перекрывающихся сигналов.55ЛGua C-5Gua C-8Gua C-4Рисунок 3. Фрагмент НМВС-спектра α-гуанинсодержащего мономера 23a.ЛAde C-5Ade C-8Ade C-4Рисунок 4.Фрагмент НМВС-спектра γ-аденинсодержащего мономера 25b.56ЛЛGua C-5Gua C-8Gua C-4Рисунок 5. Фрагмент НМВС-спектра γ-гуанинсодержащего мономера 26b.Таким образом, была полностью подтверждена структура полученных ролностьюзащащенных монмоеров 23a, 25b и 26b, также можно сделать вывод, что реакцииалкилирования защищенных пуриновых оснований бромацетамидными производнымипсевдопептидов на основе L-глутаминовой кислоты протекают региоселективно.Определения оптической чистоты тиминсодержащихмономеров.Поскольку ключевое влияние на взаимодействие ПНК с комплементарнымипоследовательностями нуклеиновых кислот имеет конфигурация хирального центра (Rили S) и его местоположение в псевдопептидном скелете, исключительно важнаоптическая чистота (не менее 95%) мономеров хиральных ПНК.Схема 10.
Синтез диастереомеров мономеров ПНК на основе L- и D-Ala [108].TON31, 32NH33L-Ala(OtBu)OBocHNNBocHNTCOOHOOOTTDBTUDIEAOBocHNNONHOO3457Так как первыми хиральными мономерами ПНК были α-производные, торазработка методов определения энантиомерной чистоты ПНК началась с них. Dueholm K.L.
et al. [108] опробовали метод, основанный на получении диастереомеров 33 и 34, присинтезе α-мономеров ПНК на основе аланина, конденсацией конечных мономеров 31 и 32(из L-, D-аланина, соответственно) с трет-бутиловым эфиром L-аланина (Схема 10).Разделение при помощи ВЭЖХ показало, что оптическая чистота диастереомера измономера ПНК на основе L-аланина 94%.TTOOONBocHNR35a-cONHBocHNONHR36a-cOONOR=-CH2OBn -CH2CH2COOBn, -(CH2)4NH-2-ClZacbРисунок 6. Диастереомеры мономеров ПНК на основе L-Ser, D-GIu, L-Lys [81].Позже Nielsen P.
E. et al. [81] использовали аналогичный подход для определенияЭЧ мономеров на основе L-Ser, D-GIu, L-Lys. С этой цель были получены диастереомерыреакцией целевых мономеров с L-Ile (35а-с) и (L,D)-Ile (36а-с) (Рис. 6). Разделение смесидиастереомеров, на основе рацемического изолейцина, и хроматография остальныхдиастереомероввподобранныхусловияхпоказала,чтооптическаячистотадиастереомеров составляет 90%.Схема 11. Синтез диастереомеров мономеров ГПНК и миниПЭГ ПНК [4, 109].F3CPhMeOTORH3NNCOOHTClODIEA, DCMNCbzaNHN37a,bR=HNNHCbzORF3COPhOMeCOOH38a,bR=OObOПри синтезе γ-мономеров ГПНК Ly D. H.
et al. [4] использовали косвенный метод,основанный на 19F-ЯМР-спектроскопии. С этой целью были приготовлены диастереомеры38а припомощиконденсациимономеров с реагентом Мошера (α-метокси-α-(трифторметил)фенилацетил хлорид) (Схема 11). Анализ ЯМР-спектров на ядрах F-19показал, что энантиомерная чистота диастереомеров >99%. Аналогичная стратегия была58применена в случае получения мономеров миниполиэтиленгликоль (ПЭГ) ПНК 37b ирезультаты по оценке энантиомерной чистоты оказались схожими с результатами поГПНК [109].NHBocCOOtBuOTONFmocHNTCOOHNFmocHN39a,bCOOH40a,bРисунок 7.
Мономеры γ-ПНК на основе GIu и Lys [110, 111].Корейская группа под руководством Lee W. использовали прямой метод дляопределения оптической чистоты мономеров ПНК. Так для разделения энантиомерныхформ Fmoc-мономеров γ-ПНК на основе L-глутаминовой кислоты 39a,b (Рис. 7) былаиспользована стационарная фаза Chiralpak IB, иммобилизованная полисахаридами.Разделение рацемической смеси при помощи ВЭЖХ и последующее хроматографиятиминового мономера на основе L-глутаминовой кислоты, показали, что энантиомернаячистота мономера составляет >99.9% [110]. Аналогичные результаты были получены вслучае γ-мономеров ПНК 40a,b на основе L-Lys (Рис. 7) [111].OONHNBocHNOONиз L-Glu 45a(-S)из D-Glu 46a(-R) OHNBzlOOOHBocHNOOONONOH45b(-S) из L-Glu46b(-R) из D-GluOBzlРисунок 8.
Структуры тиминовых мономеров ОЗ ПНК.В нашей работе был реализован прямой метод определения энантиомерногоизбытка на примере тиминовых α-мономеров 45a, 46а и γ-мономеров 45b, 46b (рис. 8),которые были синтезированы, по раннее описанной стратегии (схема 12). Использованиепрямого метода было обусловлено тем, что в случае проведения предварительнойдериватизации мономеров 45a, 46а по С-концу возможна частичная рацемизация, чтонаблюдалось при проведении анализа диастереомеров на основе L- и D-Ala [7].59Схема 12. Синтез энантиомеров тиминсодержащих мономеров ОЗ ПНК.ONHNBrBocHNOOHNBrAcBrOAllBocHNTEA 0 oC21a, 41aNOTOAll K2CO3 BocHNOO22a, 42aOOBzlOONOAllOOBzl43a, 44aOBzl[Pd(PPh3)4]N-этиланилин45a, 46aOHNBzlOBzlOOOBrAcBrHNBocHNOTEA 0 oCBocHNOAllBzlOBrOONTK2CO3OAllOOOBocHN22b,42b21b, 41bNONOAll43b, 44b45b, 46bДляразделениясмеси(R)-и(S)-энантиомеровбыла[Pd(PPh3)4]морфолиниспользованахроматографическая колонка, загруженная новым гибридным сорбентом на основесиликагеля с иммобилизованным антибиотиком – эремомицином.
Ранее было показано,что данный хиральный сорбент обладает высокой энантиоселективностью по отношениюк модифицированным α- и β-аминокислотам и их производным [112]. Результатыразделения представлены на рисунке 9.60АRВSSRSБГSRРисунок 9. Хроматограммы разделения рацемической смеси тиминсодержащихмономеров 45b, 46b (А)а и (S)-тиминсодержащего мономера 45b (из L-Glu) (Б)а;рацемической смеси тиминсодержащих мономеров 45a, 46а (В)б и (S)тиминсодержащего мономера 45a (из L-Glu)б (Г).аколонка Diasphere-110-Chirasel-E-PA, элюент: MeOH/CH3COOH = 94/6 (v/v), скоростьпотока 1 мл/мин, UV 254 нм, температура 20°С; бколонка Diasphere-Chirasel-E, элюент:MeOH/CH3COOH/TEA=100/0.1/0.1 (v/v/v), скорость потока 0.5 мл/мин, UV 254 нм,температура 20°СРасчёт площади хроматографических пиков показал, что оптическая чистотамономера 45b составляет 99,1%, а α-мономера 45a – 95%, что представлялосьдостаточным для проведения дальнейшей олигомеризации на твердой фазе.Таким образом, было показано, что описанная стратегия синтеза мономеровобеспечивает необходимую оптическую чистоту конечных мономеров, что являетсяодним из немаловажных условий для дальнейшей олигомеризации на полимерномносителе.
Также использованный в работе сорбент может быть применен для определенияоптической чистоты других хиральных мономеров ПНК.Определение конформаций хиральных ПНК.Изучение пространственной конфигурации молекул ПНК является крайне важнойзадачей. При использовании КД-спектроскопии было показано, что ахиральные ПНКимеют неупорядоченную структуру и принимают спиральную форму только приобразовании комплекса с НК, введение же заместителя в структуру ПНК способствуетпреорганизации молекулы ПНК, причем важно положение заместителя в структуре ПНК:в случае (S)-конфигурации в γ-положения образуется правозакрученная преорганизация, вслучае α-положения левозакрученная.
При изменении конфигурации стереогенногоцентра в мономере ПНК происходит обращение конформации олигомера ПНК справозакрученной на левозакрученную (для γ-ПНК), и наоборот (для α-ПНК). Позже было61показано, что для доказательства пространственной преорганизации молекул ПНК можноиспользовать методы ЯМР-спектроскопии. Для этой цели использовался модельныйдимер, имеющий в своей структуре хиральный мономер γ-ПНК, изучение методамидвумерной ЯМР-спектроскопии подтверждало наличие правозакрученной преорганизации[79,113],новтожевремяналожениесигналоваминоэтильныхпротоновпсевдопептидных остовов препятствовало четкому определению констант спин-спиновоговзаимодействия в одномерных спектрах, которые в данном случае являются ключевымфактором для проведения исследования. Мы посчитали рациональным синтез димера,состоящего из хирального мономера на основе L-Ala и aegПНК мономера, причемметиленовые протоны в aeg-мономере замещены на атомы дейтерия, что должно былоспособствовать существенному упрощению1Н-ЯМР спектра димера и легкостиинтерпретации двумерного COSY-спектра и одномерного 1Н-спектра.С этой целью нами был проведен синтез мономера «классических» ПНК на основедейтерированного глицина (схема 13).
Гидрохлорид метилового эфира дейтерированногоглицина 48 был получен из D2-глицина 47 действием тионилхлорида в метаноле,взаимодействие 48 с (трет-бутилокси)пирокарбонатом в присутствии NaHCO3 приводилок образованию Вос-защищенного метилового эфира глицина 49. Реакцией последнего с 2нитробензолсульфонил хлоридом в присутствии триэтиламина получали Ns-производноеметилового эфира дейтерированного глицина 50. Дейтерированный Вос-этаноламин 51получали восстановлением 49 действием LiAlD4 в ТГФ.
Реакция Мицунобу междуспиртвой компонентой 51 и Ns-производным дейтерированного глицина 50 («кислотная»компонента) приводила к образованию полностью защищенного псевдопептида 52.Тиолизом псевдопептида 52 получали вторичный амин 53. Ацилирование амина 53бромацетилбромидом в присутствии триэтиамина давало бромацетамидное произовдное54. Последующее алкилирование тимина бромацетамидным производным 54 приводило кобразованию полностью защищенного тиминсодержащего мономера 55.
Удалениеметильнойзащитыдействием2MNaOHдавалоВос-защищенныйтиминовыйдейтерированный aeg-мономер 56.62Схема 13. Синтез мономера «классических» ПНК из дейтерированного глицина.OO MeOH, SOCl2H2NH2NOOH 94%*HCl 4847OBoc2OBocHNO49~100%LiAlD4NsCl, TEA58%53%ONsHNOBocHN+OH5150*=D2DEADTPP83%BocHNOHNOPhSH, K2CO3BocHN93%53ONsNO52BrAcBr, TEA, 0oC63%OBocHNNTTBrOT, K2CO3OO71% BocHNN5554O2M NaOHOO~100%BocHNNOOH56Полученный мономер 56 был введен в реакцию ацилирования по методусмешанных ангидридов (в присутствии IBCF, в качестве активирующего агента) стрифторацетатом 58 хирального мономера γ-ПНК на основе L-Ala, который был получениз полностью защищенного тиминсодержащего мономера 57 γ-ПНК на основе L-Ala,действием на него трифторуксусной кислотой в присутствии м-крезола.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
