Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств (1091937), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Олигомер быстрораспределялся к почкам, печени, легким, мышцам, селезенке и плазме, наиболее низкийуровень был обнаружен в мозге [21].Используя различные гэпмеры метилфосфонатов с фосфотиоатами в качествецентраолигонуклеотида,метилфосфонатыбылииспользованыдляочисткиаутотрансплантатов при хронической лейкемии костного мозга [15]. Ряд работ посвященизучению влияния данного вида миметиков на различные биологические объекты, такиекак рекомбиназы, топоизомеразы и др. [22, 23], также большое внимание уделеноизучению аналогов метилфосфонатов, таких как: метилфосфонотиоаты [24], 5'-Ометилфосфонаты [25] и фенилфосфонаты [26, 27].15ФосфотиоатыОбщая характеристикаФосфотиоаты – широко используемые в молекулярной биологии аналогиолигонуклеотидов (часто используется название – S-олигонуклеотиды). Фосфотиоатынашли широкое применение из-за своей нуклеазной устойчивости и достаточно простогосинтеза. Структура их подобна ОДН, в которых не участвующий в образовании эфирныхсвязей гидроксил фосфата заменен на серу [28] (рис.
5).BBOSO POOO(5`-)BO-SO POOOO(3`-)Рисунок 5. Структура фосфотиоатов [27].Наличие асимметричного атома в молекуле фосфотиоатов приводит к возможностиобразования двух диастереомеров (R и S для каждого мономерного звена), обладающихразличными свойствами [29]. Как правило наличие рацемата при взаимодействии с ОН(ОДН) понижает аффинность связывания. Разделение же диастереомеров являетсязатруднительным, что является особенно проблематичным при высокой токсичностиодного из диастереомеров или значительного понижения температуры плавлениякомплекса с ОН (ОДН) [28].Проблемахиральностичасторешаетсяприпомощизамещениявторогонеэтерифицированного атома кислорода фосфатной группы ОДН на еще один атом серы,образуя тем самым фосфодитиоаты (рис. 6).
Фосфодитиоаты имеют схожие свойства сфосфотиоатами: высокая растворимость из-за симметричного отрицательного заряда иустойчивость к нуклеазному воздействию [30].BOO(5`-)BSO POSOBSO POSOO(3`-)Рисунок 6. Структура фосфодитиоатов.Средианалоговметоксиэтилфосфоротиоатыфосфотиоатов(рис.7).Такаяследуеттакжемодификациявыделитьпоказывала2'-О-меньшуютоксичность по сравнению с классическими фосфотиоатами и более высокуюустойчивость к действию нуклеаз [31].16H3COH3COBOO(5`-)H3COBOSO POOBOOOSO POOOO(3`-)Рисунок 7.
Структура 2'-ОМОЕ фосфотиоатов.Синтез фосфотиоатовСинтез фосфотиоатов и фосфодитиоатов аналогичен синтезу метилфосфонатов, занекоторыми исключениями.OА20SSOO3H-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксид (реагент Beacauge)SБNSS SN21тетраэтилтиурам дисульфид (TEDT)Рисунок 8. Реагенты для сульфуризации.Для синтеза фосфотиоатов используются мононуклеотиды ОДН, получениеолигомеров возможно в растворе [32, 33] или с использованием твердофазного носителя.Отличительным этапом в твердофазном синтезе фосфотиоатов является стадиясульфуризации.
В качестве реагентов для проведения сульфуризации чаще всегоиспользуют: серу [34], реагент Beacauge 20 (рис. 8А) [35] или тетраэтилтиурам дисульфид21 (рис. 8Б) [36] (рис. 8). Сульфуризация – это образование фосфотиоатной связи изтриэфирфосфита 22, полученного на стадии конденсации (схема 2). Автоматическийсинтез не является стереоспецифичным, давая смесь изомеров, в случае фосфотиоатов[29].17Схема 2. Сульфуризация реагентом Beacauge в синтезе фосфотиоатов [35].O22O P ONCOSS OONCOODMTrOBODMTrOBODMTrOBBOOOO P OSOSO OOO P O 23SONCOBOBOOS20OПри синтезе фосфодитиоатов используют фосфотиоамидитные синтоны 24,конденсация с нуклеозидным звеном 25 и последующая сульфуризация приводят кобразованию фосфодитиоатной связи в олигонуклеотиде 28 (схема 3) [37].Схема 3.
Синтез фосфодитиоатов [37].ODMTrOBClOS P N24ClOS P ONH BF4+HOOBСульфуризацияOBOS P OSOBOOOO27O2625ODMTrOBClODMTrOBOOOOS P OSBOB28OВвидуразнойтоксичностидиастереомерныхформфосфотиоатныхолигонуклеотидов, несомненным достижением явился стереоспецифичный синтез такихмолекул [38].18Схема 4. Стереоспецифичный синтез мононуклеотидов фосфотиоатов [38].HOTOaO79%OH29OPbOOO83%TSPOO91%O3332T 83%P92%STOeSOcODMTrOTOdOODMTrOTOO3130HOOPOOOPS HN(C H )2 5 3O34f88%DMTrOOOPOTSHN(C H )2 5 3O35а. 1) 1Н-тетразол, СН2СН=СН2ОР[N(i-C3H7)2]2, CH3CN, молекулярные сита 3Å, 25 оС; 2)55оС, 36 ч; b.
бис[3-(триэтоксисилил)пропил]тетрасульфид, 25оС, 1 ч; c. СН3ОNa,CH3OH, 25 оС, 24 ч; d. DMTrCl, ДМФА/пиридин, 25 оС, 7 ч; e. 1) t-C4H9NH2, 35 оС, 24 ч; 2)(C2H5)3NH+HCO3-/H2O; f. 1) Pd2(dba)3∙CHCl3, (C6H5)3P, n-C4H9NH2, HCOOH, ТГФ, 25 оС, 2ч; 2) (C2H5)3NH+HCO3-/H2OМетод синтеза чистых (R)- и (S)-монотимидинфосфотиоат нуклеотидов состоит вкомбинировании стереоконтролируемых реакций (схема 4), которые включают: 1) 1Нтетразол-активированнуюконденсациютимидина(аллилокси)[бис(диизопропиламино)]фосфаном,заравновесиекполученныхпродуктов,приводякоторойследуетобразованиюс29термическое(S)-тимидина3',5'-циклического фосфата 30 в качестве главного компонента, 2) стереоспецифическуюсульфоризациюэтогокомпонентабис[3-(триэтоксисилил)пропил]тетрасульфидом,получая аллил (R)-тимидин 3',5'-циклический фосфотиоат 31, 3) региоселективный истереоселективный метанолиз соединения 31, приводящий к получению аллил (R)тимидин-3'-фосфоротиоат32,какглавногопродукта,4)послевведениядиметокситритильной защиты на свободную 5'-гидрокси группы аллилфосфотиоата 32,стереоспецифичное удаление метильной группы с фосфотиоатной группы обработкой стрет-бутиламином, приводит к образованию аллил (R)-5'-О-диметокситритилтимидин-3'фосфортиоат диэфира 34, а стереоспецифичное удаление аллильной защиты с фосфатной19группы при катализе ди-палладиевым комплексом приводит к образованию (S)-5'-Одиметокситритилтимидин-3'-фосфортиоата 35.Схема 5.
Стереоспецифичный синтез олигонуклеотидов фосфотиоатов [38].АDMTrODMTrOTOOHO+OOTa54%S HN(C2H5)3 OAcPAllO O36OAllOb88%POOOAllOcOO39DMTrOODMTrOTOHO+OS HN(C2H5)3POOTaO62%OOAc3635DMTrOTPOO38TOS-POO41b84%TOOHOOOTPOOT42OOHOAcS-OcO40TOSPTOTOSOOHOAcБTOSPT37HOTOS34ODMTrOTa) DEAD, (C6H5)3P, ТГФ, 55 оС, 3 ч; b) СН3ОNa, CH3OH, 25 оС, 4 ч; c1) 1) Pd2(dba)3∙CHCl3,(C6H5)3P, n-C4H9NH2, HCOOH, ТГФ, 25 оС, 3 ч; 2) CH3COOH, 60 оС, 4 ч; с2) 1) t-C4H9NH2,35 оС, 12 ч; 2) CH3COOH, 60 оС, 4 чСтереоспецифическая конденсация аллил (R)-тимидин 3'-фосфортиоата 34 илиметил (S)-тимидин-3'-фосфортиоата 35 с 5'-О-свободной гидроксильной группой тимидинпроизводного 36 по реакции Мицунобу приводит к (S)-динуклеотиду 37 или (R)дитимидин фосфотиоату 38, в которых сохранена стереохимия фосфотиоатной функции.Удаление ацетильной группы приводит к образованию димеров 39 и 40 со свободной 3'гидрокси группой, после чего синтез олигонуклеотида может быть продолжен додостижения необходимой последовательности.
Стереоспецифичное удаление аллильнойгруппы, катализируемое палладиевым комплексом, вместе с удалением DMTr-защитыуксусной кислотой образует (S)-фосфотиоат олигонуклеотид 41, а реакция димера 40 стрет-бутиламином с последующим удалением DMTr-защиты приводит к образованию(R)-фосфотиоат олигонуклеотида 42 (схема 5) [38].Ферментативный синтез фосфотиоатов является альтернативой химическомусинтезу. Среди межнуклеотидных связей, фосфотиоатные – самые простые дляобразованиямодифицированныхолигонуклеотидов,таккаквсечетыре(α-тио)трифосфаты (рис. 9) – хорошие субстраты для ДНК и РНК полимераз.
Вфосфотиоатахферментативноеобразованиесвязейпроисходитсобращениемконфигурации при атоме фосфора, приводя к образованию (R)-межнуклеотидной связи.20Таким образом, ферментативный синтез ограничивается получением только (R)фосфотиоатов, в качестве полимераз используются либо ДНК полимераза фага Т7, либоДНК полимераза бактерии Thermus aquaticus (Taq-полимераза) [15].OOSO P O P O P OOOOB=T,C,A,GOBOHРисунок 9. Нуклеозиды для ферментативного синтеза фосфотиоатов [15].Конъюгация олигонуклеотидов с другими биологическими макромолекулами, снерадиоактивными репортерными группами или с флуоресцентными метками требуетпроведения различных постсинтетических модификаций.
Модификации проводят либо по3'-,либопо5'-концу,используяклассическиеметодыдлявзаимодействияолигонуклеотидов с реакционноспособными аминоалкил- или меркаптоаклильнымигруппами. Введение таких функциональных групп в олигомер может быть достигнуто какпри использовании подходящих, коммерчески доступных фосфоамидитных реагентов какв твердофазном синтезе, так и при жидкофазном синтезе [15].Свойства и применение фосфотиоатовВ зависимости от диастереомерного состава, олигомер, состоящий из (S)диастереомеров стабилен при действии фосфодиэстеразы змеиного яда, но разрушаетсяпри взаимодействии с Р1 нуклеазой (из Penicillium citrinum), для (R)-диастереомерныхфосфоротиоатов взаимодейсвтие с данными ферментами происходит противоположнымспособом [38]. Сравнение деградации фосфотиоатов в различных биологическихжидкостях показало, что в среднем период полураспада таких олигнуклеотидовсоставляет около 2 ч.
Так как фосфотиоаты – отрицательно-заряженные миметики ихрастворимость в водных средах сопоставима с растворимостью ОН (ОДН) [28].Температура плавления дуплексов с ДНК (РНК), образованных фосфотиоатамивыше по сравнению с ОН (ОДН). S-Олигонуклеотиды активируют действие РНКазы Н длярасщепления РНК при образовании гибридного дуплекса, также было установлено, чтопри идентичных условиях активность РНКазы Н в отношении S-олигонуклеотидов в 1.3раза выше, чем у ОДН [28]. МИД S-олигонуклеотидов составляет 8 п.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
