Синтез мономеров полиамидных миметиков нуклеиновых кислот и исследование их свойств (1091937), страница 3
Текст из файла (страница 3)
4), которые являются аналогаминуклеозид фосфоамидитных производных.OOHNNHB=ONHOOHNNHONHDMTrOONPNH ONNHNBOR=-H, -OCH3NNNNNHDMTrOBOORCH3N11PRCNO12Рисунок 4. Фосфоамидитные синтоны для твердофазного синтезаметилфосфонатов [17].Такиесинтоныимеютзащитныефункциипо5'-гидроксильной(диметокситритильная) и амидофосфитной группам (изопропильные). В качествезащитных групп нуклеиновых оснований используют бензоильную защиту для аденина иизобутирильные группы для цитозина и гуанина. Для дезоксицитидина N-изобутирилзащитная группа используется вместо стандартной N-бензоильной группы, для11препятствования побочному процессу трансаминирования во время удаления со смолы.Часто на 5'-конец олигонуклеотида вводят фосфодиэфирную межнуклеотидную связь,используявкачествезаключительногосинтона3'-О-β-цианоэтил-N,N-бис-диизопропиламинофсфорамидит 12 (рис.
4), что позволяет облегчить процедурувыделения конечного олигомера. Время конденсации мономеров аналогично синтезуолигонуклеотидов ОН (ОДН) фосфоамидитным способом. Так как метилфосфонатныесвязи подвержены гидролизу при длительной обработке с неорганическими основаниями,то для удаления защитных групп и отщепления олигомера со смолы используютэтилендиамин.
Вначале проводят 30 мин обработку смолы раствором гидроксида аммонияпри комнатной температуре. После чего добавляют равный объем этилендиамина ипродолжают обработку в течение 6 часов. Реакцию останавливают разбавлением водой инейтрализацией либо HCl, либо уксусной кислотой. Олигомеры выделяют при помощиОФ ВЭЖХ, либо ионообменной хроматографии при наличии 5'-фосфордиэфирноймежнуклеотидной связи [17].Свойства и применение метилфосфонатовМетилфосфонаты стабильны в водных растворах с рН 7 при комнатнойтемпературе в течение, по крайней мере, 1 недели (в зависимости от состава олигомера иего длины период хранения может достигать более длительного времени).
Замороженныерастворы олигомеров могут хранится в течение 6 месяцев без значительной деградации.Особенно стабильны олигомеры при хранении в виде лиофилизованных порошков или врастворах этанола с водой или ацетонитрила с водой. В этом случае, срок храненияолигомеров достигает 1 года при -20оС. Метилфосфонаты также стабильны при мягкихкислотных условиях водного раствора.
Однако обработка с 1н HCl приводит кдепуринизации и последующему расщеплению цепей метифосфонатов. Скоростьдепуринизации,какоказалось,происходитмедленнее,чемуолигодезоксирибонуклеотидов при тех же условиях. Метилфосфонаты, состоящие из 2'-Ометилрибонуклеозидов, крайне устойчивы в кислых условиях. Так, инкубация 12-мера,содержащего как 2'-О-метилгуанинрибонуклеозид, так и 2'-О-метиладенинрибонуклеозидс 1н HCl в течение 12 ч при 37оС не приводили к гидролизу и депуринизации этихолигомеров [17].Гидролиз обоих видов метилфосфонатов осуществляется в водных растворах приосновных рН. Некоторые вторичные амины, такие как пиперидин и морфолин, особенноэффективно гидролизуют метилфосфонатные связи.
Гидролиз приводит к образованиюолигомеров и мономеров, которые терминированы либо гидроксильной группой, либо12группой метилфосфоновой кислоты. Метилфосфонатные связи устойчивы к гидролизуэкзонуклеазами, такими как фосфодиэстераза змеиного яда и фосфодиэстераза селезенки,и эндонуклеазами, такими как микрококковая нуклеаза и ДНКаза I. Растворимостьметилфосфонатов зависит от длины олигомерной цепи и количества G и C нуклеотидов.Олигонуклеотиды длиной от 12 до 16 нуклеотидов могут быть растворены в водныхбуферах, давая растворы с максимальной концентрацией олигомеров в диапазоне от500µМ до 1 mM. Олигомеры, которые содержат большое количество G остатков имеютболее низкую растворимость [17].Метилфосфонатыобразуютстабильныедуплексыскомплементарнымипоследовательностями ОН (ОДН).
Стабильность дуплексов увеличивается с увеличениемдлиныпоследовательностиметилфосфонатов.ВотличиеотДНК,вслучаеметилфосфонатов, на связывание с ОН (ОДН) не оказывает влияние ионная сила раствора.Это свойство обусловоено отсутствием электростатического отталкивания междунезаряженнымметилфосфонатнымостовомиотрицательно-заряженнымфосфодиэфирным скелетом ОН (ОДН).
Дуплексы, образованные между метифосфонатамииОДНподобныолигодезоксирибонуклеотидами.аналогичнымПолитиминовыеструктурам,метилфосфонатыобразованнымособенночувствительны к конфигурации метилфосфонатной связи. Miller et al. [18] показали, чтодекамеры, содержащие стереорегулярный остов, состоящий либо из (R)-, либо из (S)мономеров, образовывали комплексы с комплементарными ДНК и РНК различнойстабильности. Оказалось, что (R)-метилфосфонаты более стабильны, температураплавления дуплексов, образованных (S)-изомерами была ниже на 2-4оС.
Дуплексы,образованные олигомерами содержащими пуриновые основания менее чувствительны кконфигурации остова. Также гомопуриновые метилфосфнаты способны образовыватьтриплексы с дцДНК содержащими, либо гомопиримидиновую, либо гомопуриновуюпоследовательность оцДНК, причем стабильность таких триплексов выше, чем у ДНК.Метилфосфонаты не показывают РНКазной активности. Фосфоруглеродные связи вметилфосфонатах обеспечивают более высокое сродство при взаимодействии с РНК, чтоблагоприятно для антисмысловой терапии [17].Метилфосфонаты из 2'-О-метилрибонуклеозидов показывают значительно болеевысокую аффинность связывания с РНК, так комплекс 12-мера с РНК имел температуруплавления выше на 15оС, чем в случае дезоксиметилфосфонат/РНК дуплекса [17].
Miller etal. использовали метилфосфонаты из 2'-О-метилрибонуклеозидов против РНК вирусаиммунодефицита человека, которая отвечает за начало репликации вируса и представляет13собой петлеобразную структуру [19]. В ходе эксперимента были получены 7 олигомеров(13-19), принимающих структуру подобную ТАР РНК (табл. 1).Олигомеры, за исключением 16, имели в своем составе смесь диастереомеров,тогда как олигомер 16, содержащий в своем составе только две метилфосфонатные связи,тем самым образовывал четыре диастереомера (RR, SS, RS, SR), которые были разделеныпри помощи ОФ ВЭЖХ.Таблица1.Свойстваметилфосфонатных«петлей»(точкамипоказаныСтруктураОлигомерметилфосфонатные связи) [19].13CCUCGAGA1415CCUCGAGAC CC AUGCGGCAUGCAACAGGCUCAGUТm (оС)CCUCGAGA17CAGGCUCACCUCGAGACAGGCUCACCUCGAGAAAUUUC18GGAACKd (nM)CAGGCUCAGGA16CCUCGAGACAGGCUCCCCCAGGCUC197457558077605417±1.055±155.3±1.1284±9.2285±7.342±3.0~50.0В ходе исследования было показано, что наиболее высокой аффинностьюсвязывания обладают олигомеры 16 и 17, содержащие метилфосфонатные связи в петлесвязывания с ТАР РНК.
Связывание с ТАР РНК было оценено при помощи определенияконстант диссоциации с использованием гель-электрофореза, после инкубацииР-32меченной ТАР РНК с каждым олгонуклеотидом при 37оС. Константа диссоциации (Kd)представляла собой отношение концентрации образованного комплекса (в процентах) клогарифму концентрации олигомеров 13-19. Присутствие метилфосфонатных связей вначале «петли» (олигомер 15, табл. 1) увеличивает аффинность связывания с РНКпримерно в 5 раз по сравнению с олигомером 13, не содержащим метифосфонатные связи.Влияние конфигурации метилфосфонатной связи на аффинность к ТАР РНК былооценено на олигомере 16 (табл. 2), так наиболее высокое сродство к ТАР РНК показывал14(RR)-диастереомер, тогда как (SS)-диастереомер показывал аффинность в 4 раза ниже.Таким образом, на аффинность связывание метилфосфонатов может оказывать не толькоконфигурации связи, но и ее местоположение в составе олигомера.Таблица 2.
Влияние конфигурации метилфосфонатных связей в олигомере 11 насвязывание с ТАР РНК [19].Диастереомеры олигомера 16Kd (nM)RR117±15SR232±57RS301±26SS520±75Метилфосфонаты способны проникать через клеточные мембраны клетокмлекопитающих. Так проникновение тиминовых (3Н-меченный по 5-положениюметильной группы тимина) метилфосфонатов (длиной два, пять и девять нуклеотидов) вфибробласты сирийского хомяка осуществлялось в течение 3 ч.
После лизиса клеток 94%олигонуклеотида было обнаружено в виде интактного соединения. Но также былиобнаружены тритий-меченные нуклеотиды в составе клеточной ДНК, что, по-видимому,указывает на возможность отщепления тимина при помощи гликозилазы [14, 20].Метилфосфонаты длиннее 4-х нуклеотидов не были способны проникать в E. coli, повидимому, клеточная стенка непроницаема для низкомолекулярных олигомеров, чтотакже наблюдается для коротких пептидов и полисахаридов [17].После инъекции тритий-меченныго по 5-положению метильной группы тиминаметилфосфонатного олигомера TCCTCCTGCGG в хвостовую вену мыши, былоопределенно биораспределение по различным тканям. Полупериод распределения потканям составил 6 мин., тогда как время удаления из кровотока 17 мин. Около 70%олигомера было обнаружено в моче спустя 60-120 мин после введения.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
