Диссертация (Молекулярные и клеточные механизмы ультрафиолетового сшивания роговицы), страница 13

et al., 2014; Yildirim Y., et al., 2017; Razmjoo H. et al., 2017).Schumacher S. с коллегами подтвердили близость результатов испытанийпрочностно-механических свойств свиных роговичных полос, сшитых ускоренным(10 мВт/см2, 9 мин) и традиционным методом (3 мВт/см2, 30 мин) (Schumacher S. etal., 2011). Установлен сходный характер структурных изменений пластинокстромального коллагена и его разрывной прочности под воздействием обычногосшивания и А-CXL свиных роговиц (McQuaid R. et al., 2014).

В целом оцениваютсякак положительные результаты наблюдений А-CXL (30 мВт/см² и 3 мин) роговицы укошек с кератомаляцией (Famose F., 2015). Роговицы кроликов in vivo, насыщенныес помощью ионофореза и сшитые при 10 мВт/см2 в течение 9 мин, обладалиповышенной жесткостью и возросшим сопротивлением к давлению (Touboul D. etal., 2014). При этом, данный режим сшивания не влиял на плотностьэндотелиальных клеток роговицы (Kymionis G.

et al., 2014).Сравнительное клиническое исследование среди пациентов с КК, один глазкоторых был пролечен методом А-CXL (7 мВт/см2, 15 мин), а другой – S-CXLспособом (3 мВт/см2, 30 мин) показало сопоставимые клинические результаты с58точки зрения безопасности, эффективности и предсказуемости исходов лечения. Упациентовнаобоихглазахнаблюдалосьулучшениеостротызренияикератометрических параметров, при этом отсутствовали какие-либо побочныеэффекты, в том числе признаки повреждения эндотелия (Kanellopoulos A., 2012).Аналогичные сведения получены Hashemi H.

и соавт. при наблюдении в течение 6мес 31 пациента с прогрессирующим КК, пролеченного с использованиемпараметров 18 мВт/см2, 5 мин (Hashemi H. et al., 2015). Mita M. с соавт. представилианалогичные результаты клинических наблюдений, при этом А-CXL выполнялся врежиме 30 мВт/см2 в течение 3 мин (Mita M. et al., 2014; Tomita M. et al., 2014).Однако, существует мнение, что сокращение продолжительности облученияпри увеличении мощности УФ излучения не позволяет получить идентичнуюстепень связывания фибрилл коллагена (Spoerl E. et al., 2004а). Wernli J. с соавт.,исследовав биомеханику свиной роговицы после А-CXL в диапазоне от 3 до 90мВт/см2 и от 30 до 1 мин, соответственно, сделали заключение о различиях вэффективности УФ сшивания в пользу стандартного способа (Wernli J. et al., 2013).По данным атомно-силовой микроскопии свиные роговицы, обработанные поДрезденскому протоколу, в сравнении с А-CXL (30 мВт/см2, 3 мин), обладали болеевысокой корнеальной жесткостью, демонстрируя существенное увеличение модуляЮнга (Dias J.

et al., 2015). На основании изучения техники А-CXL в дозе 18 мВт/см2,5 мин Cingu A. и соавт. пришли к такому же заключению (Cingu A. et al., 2014). Былопоказано, что А-CXL, как и S-CXL повышал устойчивость свиных роговиц кферментативному расщеплению, по сравнению с нормой, однако лучшие результатыкорнеальной резистентности обеспечивала все-таки традиционная техника сшивания(Aldahlawi N. et al., 2015).Таким образом, до настоящего времени не принята единая техникаускоренного УФ сшивания в виду недостаточных экспериментальных иклинических наблюдений.Сферы применения УФ сшивания роговицыМногочисленныеэкспериментальныеиклиническиеисследования,проведенные к настоящему времени, показали высокую эффективность УФсшивания роговицы. Процедура ультрафиолетового кросслинкинга позволяет59стабилизировать биомеханические и топографические показатели роговицы,приостановить прогрессирование заболевания, добиться позитивной динамикиизменения остроты зрения и существенно повысить качество жизни пациентов(Бикбова Г.М.

и соавт., 2008, 2011а; Бикбов М.М. и соавт., 2009, 2011б, 2013, 2016,2017; Greenstein S. et al., 2011; Hersh P. et al., 2011; Caporossi A. et al., 2011, 2013;McQuaid R. et al., 2013; Hashemi H. et al., 2013; Зайнуллина Н.Б. и соавт., 2013;Agrawal V., 2013; Жабрунова М.А. и соавт., 2014; Малюгин Б.Э. и соавт., 2014).Данные о росте заболеваемости КК в педиатрической практике способствовалиприменению этой методики у детей (Abdelmassih Y. et al., 2017; Knutsson K. et al.,2018; Mazzotta C. et al., 2018). Представлены результаты экспериментальныхисследований CXL в качестве метода лечения проникающих и непроникающихранений роговицы (Нероев В.В. и соавт., 2012а; 2012б). Установлено, чтокомбинация УФ-А и рибофлавина ингибирует бактериальный рост и несетпотенциальные возможности лечения инфекционных кератитов (Ruane P.

et al., 2004;Martins S. et al., 2008; Makdoumi K. et al., 2010). Имеются данные о наличиипаллиативного терапевтического эффекта применения CXL у пациентов с буллезнойкератопатией (Бикбова Г.М. и соавт., 2008; Бикбов М.М. и соавт., 2011). УФсшивание роговицы в сочетании с имплантацией интрастромальных сегментов иликолец способствует существенному повышению рефракционных результатов(Бикбов М.М., Бикбова Г.М., 2012). Имеются данные, что CXL комбинируют слазерным кератомилезом LASIK (Celik H. et al., 2012). Методику УФ сшиванияиспользуют для обработки биосинтетических (Wand K. et al., 2015) иаллороговичных (Subasi S.

et al., 2017) имплантов, донорской роговицы с цельюпоследующей кератопластики (Ковшун Е.В. с соавт., 2014; Мороз З.И. и соавт.,2014). Появились сообщения об успешном использовании метода в клинике прилечении больных микробным кератитом (Garg P. et al., 2017), язвой (Spoerl E. et al.,2004а) и эрозией роговицы (Соколов В.О. с соавт., 2017). Предложено локальное(секторальное) УФ сшивание роговицы, как способ повышения стабильности иостроты зрения у пациентов после радиальной кератотомии в анамнезе (АнисимовС.И.

и соавт., 2010). CXL успешно применяют для повышения биомеханическихсвойств гидрогелей из внеклеточного матрикса, используемых в тканевой60инженерии (Ahearne M., Coyle A., 2016). Появилось сенсационное сообщение обиспользовании лазерной фотоактивации наночастиц рибофлавина, приводящего кприостановке роста раковых клеток в эксперименте (Khaydukov E.V. et al., 2016).Для успешной реализации многочисленных новаторских идей применения этоймедицинской технологии воплощаются оригинальные технические решения,активно внедряются новые инженерные и биофармацевтические разработки(Бикбова Г.М.

и соавт., 2010; Бикбов М.М. и соавт., 2010, 2010а, 2010б, 2011а, 2013;Халимов А.Р. и соавт., 2013; Дроздова Г.А. с соавт., 2015).Таким образом, совершенствование методики УФ сшивания роговицыохватывает оптимизацию клинических протоколов и расширение показаний к ееприменению. Использование этой уникальной, относительно новой технологии,позволяющей эффективно воздействовать на патогенетические механизмы развитияряда заболеваний роговицы глаза, способствовало созданию целого научногонаправления, основанного на фотохимическом воздействии на ткани живогоорганизма и изолированные биоткани.Представленные в обзоре литературы, сведения указывают на многообразие ипротиворечивуютрактовкуиммунобиохимических,морфофункциональных,ультраструктурных, биометрических и биомеханических изменений роговицы,обусловленных действием рибофлавин-ультрафиолета.

Завершенность процессасшивания роговицы характеризуется возрастанием ее жесткости, увеличениемрезистентностикпроцессамферментативногоразложения,повышениемустойчивости к воздействию повышенных температур, уменьшением корнеальнойпроницаемости. Наряду с совершенствованием самой техники УФ сшиванияроговицы расширяются сферы применения и спектр показаний к ее проведению, чтосвязано с очевидной простотой метода, его малой инвазивностью, сочетающейся свысокой эффективностью.

Ведутся активные поиски новых потенциальныхвозможностейпримененияэтойперспективыиспользованиятехнологии,принциповоткрываютсядополнительныеультрафиолетовогосшиваниябиологических тканей в клинической медицине, физиотерапии, молекулярнойбиологии и биотехнологии.61К настоящему времени назрела необходимость персонализированногоподхода к выполнению УФ сшивания роговицы на основе индивидуальных данныхо ее состоянии, что требует разработки новых фотосенсибилизаторов, позволяющихизбирательно проводить данную процедуру. Накоплено недостаточно данных,описывающих механизмы реализации УФ сшивания. Требуют обобщения сведения,охватывающие патофизиологические аспекты рибофлавин-УФ-А индуцированноговлияния на орган зрения и организм в целом, что и послужило основанием длявыполнениянастоящегоисследования.Изучениединамикиизмененийцитокинового, биохимического и морфологического состояния роговой оболочки,особенностей внутриклеточной сигнализации процессов апоптоза и пролиферациимогут дать дополнительную информацию о характере течения и механизмахпроцесса ультрафиолетового сшивания роговицы в различных условиях.62ГЛАВА 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1.

Общая характеристика материала и методов моделированияультрафиолетового сшивания роговицыВ основе экспериментальной работы лежат патофизиологические исследованияс воспроизведением УФ сшивания роговицы глаза, выполненные на 96 беспородныхполовозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 280±20 г, в отдельных группахиспользовались 164 кролика-самца породы «Шиншилла» массой 2,9±0,2 кг; втоксикологические исследования были включены 45 морских свинок-самцовальбиносов, 80 мышей-самцов.Все эксперименты проводились в соответствии с нормативными документами,регламентирующими гуманное обращение с животными и порядок проведениялабораторных исследований (Приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003 г.

«ОбутвержденииправиллабораторнойпрактикивРоссийскойФедерации»,«Европейская Конвенция о защите позвоночных животных, используемых дляэкспериментов или в иных научных целях», Страсбург, 18.03.1986 г.). Животныхсодержали в соответствии с требованиями ГОСТ Р 53434-2009 от 02.12.2009 г.«Принципы надлежащей лабораторной практики (GLP)».Объекты исследования были разделены на 6 групп: 1-ая – интактные(контроль), во 2-ой производили УФ облучение роговицы без рибофлавина, в 3-ей –УФ сшивание с раствором изоосмотического рибофлавина (группа сравнения), в 4-6– УФ сшивание с разработанными растворами рибофлавина (соответственно,Декстралинк, Риболинк и Хитолинк).Животные содержались при комнатной температуре 22±2ºС в условияхвивария с соблюдением стандартного рациона питания и свободного доступа к воде.Для исследований отбирали внешне здоровых животных, прекращая их кормлениеза 12 ч до начала эксперимента без ограничения потребления воды.Изъятие свиных глазных яблок производили от внешне здоровых животныхпосле их забоя.

Глазные яблоки помещали в термоконтейнер, поддерживающийтемпературу около 8ºС. Эксперименты выполняли не позднее 2 ч после изъятия глаз.63Модель стандартного УФ сшивания роговицы глаза крыс in vivoвоспроизводилась под внутримышечным наркозом препаратами «Кетамин» (50мг/кг) и «Ксилазин», 20 мг/кг (ОДО «Ветфарм», Беларусь), местной анестезией(инстилляции глазных капель 0,4% оксибупрокаина – «Инокаин», Индия).Корнеальнуюдеэпителизацию(Epi-Off)проводилимикрохирургическимшпателем на участке роговицы, отмеченном метчиком диаметром 3 мм сиспользованием операционного микроскопа Carl Zeiss (Германия).

Облучениероговицы выполняли с помощью «Устройства офтальмологического дляультрафиолетового облучения роговицы глаза «УФалинк» (Россия) на основесветодиодов ROITHNER LASERTECHNIK марки UVLED370-10Е (Австрия)длиной волны 370 нм при мощности 3 мВт/см2 продолжительностью 10 мин. Впослеоперационном периоде двукратно в течение 3-х дней закапывалиантибактериальныесредства(левофлоксацин0,5%,«Белмедпрепараты»,Беларусь).УФ облучение роговицы глаза кроликов in vivo выполняли в условияхоперационной вивария.