Диссертация (Молекулярные и клеточные механизмы ультрафиолетового сшивания роговицы), страница 11

Matalia H. c соавт. определили супрессию антиапоптозного Bcl-2 иактивацию ВАХ белка в УФ-облученных ex vivo культивируемых лимбальныхклетках эпителия, кроме этого выявлена повышенная экспрессия ферментовклеточной гибели – каспазы-3 и -9. Примечательно, что в присутствии рибофлавинаактивация факторов апоптоза была менее выраженной (Matalia H. et al., 2012).Messmer E.

и соавт. задаются вопросом, имеет ли отношение активация апоптоза кCXL, поскольку ранее установленное усиление клеточной гибели обнаруживается вовсех стромальных слоях роговиц с КК. Избыточный апоптоз кератоцитов в переднейстроме УФ-сшитой роговицы, наблюдаемый на глубине 50 мкм и связанный, какправило, с травмирующим воздействием деэпителизации, компенсируется в течениенескольких дней за счет репопуляции активировавшихся роговичных клеток(Messmer E. et al., 2013). CXL приводит к УФ-дозозависимому повреждениюкорнеальных кератоцитов на глубине до 300 мкм.

Причем УФ-А-индуцированный48апоптоз стромальных клеток в эксперименте выявлен уже через 24 ч после операции(Wollensak G. et al., 2004а).Современные исследования последствий окулярного УФ облучения крыс invivo при длине волны 300 нм без рибофлавина в течение 15 мин указывают наиндуцирование процессов апоптоза во всех трех слоях роговицы, которые через 5 чобнаруживаются гибелью эпителиальных клеток, керато- и эндотелиоцитов,достигая максимума через 24 ч (Kronschlаger M. et al., 2015).ТрансмиссионнаяэлектроннаямикроскопиякадаверныхCXL-обработанных роговиц человека показала наличие разволокнения структурыстромы и появление в ней апоптотированных кератоцитов на глубине только 50100 мкм (Зотов В.В.

и соавт., 2012).Wollensak G. и Herbst H. описывают появление в передней строме (250 мкм)после CXL глаза кролика in vivo характерного лакунарного отека, вызванногогибелью кератоцитов и являющегося причиной временного хейза (помутнения)роговицы (Wollensak G. et al., 2010б). Эти исследования подтверждены иклиническими наблюдениями: по данным конфокальной микроскопии у пациентов сКК, пролеченных CXL, в раннем послеоперационном периоде (до 7 дней)наблюдаются признаки эпителиопатии с полиморфизмом клеток базальногоэпителия.

В передней строме (до 300 мкм) выявляется апоптоз кератоцитов,обуславливающий явления псевдохейза (Бикбова Г.М., Заболотная В.А., 2011).Наряду с активацией апоптоза кератоцитов и формированием корнеального хейзапосле CXL может наблюдаться деградация роговичного коллагена III типа (Xia Y. etal., 2014).S-CXL роговиц кроликов in vivo способствует появлению активныхфибробластов и новых коллагеновых волокон (Карселадзе А.И.

и соавт., 2011). Приэтом авторы исследования указывают на сохранность эндотелия и отсутствиеявлений некроза, характерного для ожогов роговицы. В то время, как по даннымEsquenazi S. с соавт. между 1 и 3 днями после CXL на облученной площадинаблюдаются как некротизированные, так и апоптотированные кератоциты, через 11дней процесс клеточной гибели не обнаруживается.

Иммуногистохимическоеисследование роговиц кроликов после CXL показало отсутствие воспалительных49клеток инфильтрации – CD-3-позитивных, Т-активированных и клеток смиелопероксидазной активностью в зоне УФ сшивания в течение 10 дней. Однакоэти клетки можнонаблюдать в области, примыкающей к CXL. Ослабленныйиммунный ответ, по мнению авторов, может быть связан со сложностью клеточноймиграции, обусловленной уплотнением стромы (Esquenazi S. et al., 2010).Использование HRT II конфокальной лазерной сканирующей микроскопии упациентов после CXL позволило установить глубину сшивания стромальногоколлагена, которая, по мнению ряда авторов, определяется в виде разделительной«демаркационной» линии до 340 нм, визуализация которой может быть обусловленаусловиямипроведенияCXL(LhuillierL.etal.,2018).Стабильностьморфологических результатов подтверждена трёхлетними наблюдениями (MazzottaC.

et al., 2008). Однако молекулярные механизмы сшивания коллагена роговицынедостаточно изучены. Они зависят от наличия кислорода и карбонильных групп вколлагеновыхмолекулахиохватываютнетолькомежфибриллярныевзаимодействия, но и сшивки компонентов основного вещества стромы. Учитываяуже известные особенности, используемый термин «сшивание роговичногоколлагена» не совсем верен, в сущности правильным будет выражение «сшиваниероговицы», которая наиболее объективно отражает механизм процесса.Таким образом, подавляющее большинство суждений об усилении апоптоза вслоях роговицы после CXL строятся по установленной морфологической картинегибели кератоцитов, которое клинически проявляется лакунарным отеком ивременным хейзом.

Следует отметить, что результаты ряда наблюдений,посвященных изучению механизмов клеточной гибели при CXL, были получены вкультуре клеток ex vivo или при исследовании человеческих роговиц с КК, которыезаведомо имеют характерный патологический фон, включающий в т.ч. и активациюапоптоза кератоцитов во всех слоях роговицы (Messmer E.M. et al., 2013) и,соответственно, не дают точного ответа о путях индукции апоптотическихпроцессов, обусловленных УФ сшиванием.УФ сшивание, протеиназная и термическая устойчивость роговицыУФ кросслинкинг стромального коллагена роговицы свиньи повышает ееустойчивость к ферментативному расщеплению трипсином, пепсином, коллагеназой50(Spoerl E.

et al., 2004а). Лоскуты из свиных рибофлавин-УФ-обработанных роговиц,помещенные в раствор с коллагеназой А, сохраняют прочностные свойства нетолько в переднем слое до 200 мкм, но и на глубине от 200 до 400 мкм (Schilde T. etal., 2008). Исследования Малюгина Б.Э. c соавт. также показали, что донорскиеCXL-обработанные роговицы человека обладают резистентностью к действиюколлагеназы, сохраняют при этом компактное межламеллярное пространство ипоперечную направленность пластин коллагена без признаков разрушения(Малюгин Б.Э. и соавт., 2014а).Описано, чторибофлавин-УФ-А-сшитый коллаген обладает меньшейспособностью к набуханию (Wollensak G. et al., 2007).

При этом установленоснижение стромального давления и отека свиных и человеческих роговиц ex vivoпри погружении роговичных дисков в солевой раствор (Sondergaard A. et al., 2013).CXL-обработанные свиные роговицы in vitro проявляют термомеханическуюстабильность к воздействию повышенных температур (водяная баня), причем болеевысокая термоустойчивость была характерна для лоскутов передней, более сшитойстромы по сравнению с задней (Spoerl E. et al., 2004б).Биомеханика роговицы при УФ сшиванииКачественные изменения структурной организации роговичного коллагена,которые наблюдаются после УФ сшивания, указывают на восстановление одной изважных функциональных особенностей роговицы – повышение её прочностномеханических свойств, что является определяющим в остановке прогрессированиякератоэктазий (Петров С.Ю.

и соавт., 2015). Изменяющаяся по времениинтракорнеальная морфологическая трансформация, наблюдаемая после проведенияCXL, точно коррелирует с динамикой развития зрительных функций (Mazzotta C. etal., 2012).Известно,чтовтечениежизнижесткостьчеловеческойроговицыувеличивается примерно в 2 раза (Knox Cartwright N. et al., 2011). Это может бытьсвязано с дополнительной возрастной неферментативной сшивкой, затрагивающейстромальные коллагеновые фибриллы(Elsheikh A. et al., 2007). Жесткостькорнеальной ткани при КК составляет около 70% от прочностных свойств здоровойроговицы (Andreassen T. et al., 1980). Oxlund H. и Simonsen A.

пришли к выводу, что51снижение механической стабильности конусных роговиц не связано с изменениямив молекулярной структуре и аминокислотном составе коллагена (Oxlund H.,Simonsen A., 1985). По данным разных авторов, прочность коллагена зависит отдиаметра образующих его фибрилл (Parry D.A., 1988) и их длины (Silver F.H. et al.,2000). Показано, что боковое межфибриллярное связывание первостепенно вформировании устойчивости ткани при низкой деформации, в то время каклинейное сцепление, приводящее к удлинению фибрилл, призвано обеспечиватьпрочностные свойства при высокой деформации (Christiansen D.

et al., 2000).Рибофлавин-УФ-А-индуцированное сшивание коллагена ex vivo приводит кповышению механической прочности свиных роговиц более чем на 70%,человеческих – на 328%; при этом наблюдается увеличение коэффициентапродольной упругости (модуля Юнга) в 1,8 и 4,5 раза, соответственно (Wollensak G.et al., 2003а).

Долгосрочные результаты (8 мес) CXL также демонстрируютзначительное увеличение предела прочности, модуля упругости Юнга и уменьшениепредельной деформации корнеальной ткани кролика in vitro (Wollensak G., IomdinaE., 2009б). Свиныесохранялии человеческие донорские роговицы после CXL ex vivoбиомеханическуюустойчивостьккомпрессионнымизменениямвнутриглазного давления (Kling S. et al., 2010; Knox Cartwright N. et al., 2012).УвеличениежесткостиCXL-обработанныхсвиныхроговицвыявленопреимущественно в наружной строме (до 200 мкм), которая поглощает до 70%энергии УФ-А излучения.

Лоскут из средней стромы (от 200 до 400 мкм) уступает попрочности передней – примерно в 1,5-2 раза (Kohlhaas M. et al., 2006). Данныеатомно-силовой микроскопии также указывают на то, что эффекты сшиванияколлагена ограничиваются преимущественно передней стромой (до 200 мкм) и нераспространяются на более глубокие области роговицы (Dias J. et al., 2013).Показатели коэффициента резистентности и гистерезиса, описывающиеэластичные свойства роговицы, у пациентов с КК снижены в сравнении с нормой.При этом установлена низкая корреляционная зависимость между толщинойроговицы и величиной гистерезиса, который может меняться в течение суток врезультате изменений корнеальной гидратации (Luce D.A., 2005; Moshirfar M. et al.,2013). После УФ сшивания на фоне КК величина эластичности роговицы становится52еще меньше (Braun E.

et al., 2005). Тогда как, по другим сведениям повышеннаяпосле CXL жесткость роговиц не влияет на данные корнеального коэффициентарезистентности и гистерезиса у пациентов до и через 6 мес после процедуры(Sedaghat M. et al., 2010).CXL, проведенный у больных кератэктазиями, может вызывать снижениечувствительности роговицы, с постепенным ее восстановлением в течение 6 мес,причем ТE-CXL вызывает менее выраженную гипестезию (Wasilewski D. et al.,2013; Spadea L. et al., 2015). Mazzotta C.

и соавт., используя конфокальнуюмикроскопию у пациентов с прогрессирующим КК, наблюдали исчезновениесубэпителиальныхстромальныхнервныхволоконвцентральнойУФ-Аоблученной (370 нм, 3 мВт/см2) зоне роговицы, при этом область периферииосталасьнезатронутой.Поданнымавторов,процесспоследующейнейрорегенерации с полным восстановлением чувствительности переднейсубэпителиальной стромы занимает 6 мес (Mazzotta C. et al., 2006).Установлено, что вследствие уплотнения стромального коллагена после CXLпроисходит снижение корнеальной проницаемости для последующих инстилляцийлекарственных препаратов, что необходимо учитывать при медикаментознойтерапии сопутствующей офтальмопатологии пациентов с УФ сшиванием в анамнезе(Stewart J.

et al., 2011; Tschopp M. et al., 2012). Имеются сведения, что CXLопосредованное изменение жесткости роговицы может влиять на точностьизмерений истинного внутриглазного давления (Romppainen T. et al., 2007).Таким образом, степень жесткости УФ сшитых роговиц зависит отэффективности процессов связывания корнеального коллагена, на которыеоказывают воздействие содержание рибофлавина в строме, доза облучения иисходное состояние роговой оболочки. Кроме CXL на прочностные и эластичныесвойства ткани роговицы может дополнительно влиять содержание в ней влаги.Однако эти данные носят ограниченный характер.Стандартный протокол УФ сшивания роговицыSpoerl E.