Диссертация (Молекулярные и клеточные механизмы ультрафиолетового сшивания роговицы), страница 10

В механизме II типа,возбужденный триплетный рибофлавин взаимодействует с кислородом и образуетсупероксид-анион или синглетный молекулярный кислород. Таким образом,распределение АФК, образующихся в рибофлавин-фотосенсибилизированнойсистеме, зависит от наличия кислорода, концентрации рибофлавина и присутствияокисляющихся компонентов.

Кислородозависимый механизм II типа большейстепени распространен в передних слоях роговицы, в то время как механизм I типаинтенсивнее протекает начальной фазе УФО, при которой строма полностьюпропитана рибофлавином, или в задних корнеальных слоях с меньшим содержаниемкислорода. Улучшение диффузии рибофлавина в роговицу может усилить механизмI типа и, соответственно, эффект сшивания коллагена (Lombardo M.

et al., 2015; LinJ., 2018).McCall A. с соавт. нашли подтверждение тому, что рибофлавин,индуцирующий фотосенсибилизацию, фотоокисление и фотополимеризациюклассически связан с производством синглетного кислорода (McCall A.S. et al.,2010). Последний вступает во взаимодействие с доступными группами, вчастности, тирозина и гистидина в составе коллагенов и протеогликанов стромы44роговицы.Экспериментальноустановлено,чтосшивающиереакцииврибофлавин-УФ-А обработанных роговицах с участием синглетного кислородаингибируются азидом натрия, а усиление такого взаимодействия может бытьдостигнуто использованием рибофлавина, растворенного в тяжелой воде D2O(оксид дейтерия).

Это позволяет увеличить период полураспада синглетногокислорода, придавая ему, таким образом, больше времени для создания активныхрадикалов, участвующих в процессе сшивания, что обеспечивает дополнительнуюжесткость роговицы (McCall A. et al., 2010).Кроме фотосенсибилизирующих свойств при УФО рибофлавин оказываетзащитное действие на ткани роговицы. В частности при CXL роговиц с КК онспособствует синтезу нормального межклеточного матрикса и снижению уровняоксидаз, АФК и соответственно АФК-ассоциированных нарушений (Spoerl E.

etal., 2011; Cheung I. et al., 2014а).Увеличение продолжительности рибофлавин-УФ-А обработки свиныхроговицнекорнеальныхприводиттканей.кжелаемомуНапротив,повышениюдлительноепрочностныхоблучениесвойствспособствуетструктурному ослаблению роговиц (Lanchares E. et al., 2011). Spoerl E. и соавт.определили, что повышение концентрации рибофлавина в строме обратнопропорционально степени связывания фибрилл коллагена и, соответственно,росту ее биомеханических характеристик (Spoerl E.

et al., 2004а).Schilde T. с соавт. было показано, что стандартные параметры УФО вприсутствии рибофлавина приводят к абсорбции около 90-95% энергии излучения, втом числе в роговице на глубине до 200 мкм – 65%, от 200 до 400 мкм – только 2530%. По мнению исследователей, структурные изменения в составе коллагенапроисходят, в основном, в верхних и, в меньшей степени, в средних слоях роговицы(Schilde T.

et al., 2008).Морфологические особенности роговицы при УФ сшиванииЛечение КК методом CXL способствует улучшению ультраструктурнойорганизации роговицы: увеличивается переплетение ламелей в передней строме, всредней – упорядочивается чередование коллагеновых пластин, в отличие отразволокнённых при кератэктазиях (Akhtar S.

et al., 2013). Анализ, проведенный45методом иммуногистохимии, показал увеличение диаметра волокон коллагена I типау роговиц с КК, сшитых ультрафиолетом-А (Mencucci R. et al., 2010).Интрафибриллярное расстояние в роговицах после УФ сшивания сопоставимос нормальными значениями, хотя не исключено, что наблюдаемые изменения могутбыть связаны с послеоперационным отеком роговицы (Akhtar S. et al.,2013).Показано, что в передней строме роговицы кроликов в зоне активного воздействиярибофлавина и УФ-А наблюдается более выраженное увеличение диаметраколлагеновых волокон по сравнению со средней и задней стромой (Wollensak G. etal., 2004б). По данным Choi S. и соавт.

УФ сшивание донорских роговиц на моделяхin vitro способствует увеличению диаметра фибриллярного коллагена (до 103%) иего плотности (до 112%); наблюдается также повышение корнеальной толщины всреднем до 107% (Choi S. et al., 2013).Результаты определения диаметра и плотности коллагеновых фибрилл ввышеуказанных исследованиях основаны на использовании разных протоколовCXL, при этом они существенно отличаются сроками наблюдения. Остаетсяоткрытым вопрос о влиянии на межфибриллярную плотность обезвоживающегодействия рибофлавин/декстрана, используемого для предварительного насыщениястромы. Ряд исследований указывают на увеличение межфибриллярного расстояния,другие напротив – на уменьшение (Pinelli R.

et al., 2009).Существует тесная взаимосвязь между образованием коллагеновых фибрилл исодержанием основных протеогликанов (люмикан, мимекан, кератокан, декорин)(Chakravarti S., et al., 2000), синтез которых после CXL нормализуется (Akhtar S. etal., 2013). По данным Hayes S. и соавт., рибофлавин-УФ-А индуцированныепоперечные связи образуются не только внутри или между фибриллами коллагена,но и на их поверхности и окружающей сети адгезивных белков (Hayes S. et al., 2013).В свою очередь, на модели in vitro с коллагеном I типа и основныминегликозилированными протеогликанами при воздействии УФ-А-рибофлавина былопоказано, что кератокан и люмикан ингибируют коллагеновое сшивание, тогда какмимекан и декорин способствуют образованию межфибриллярных связей.

Однако, втом случае, если воздействие УФ-А-рибофлавина проводится на интактныхроговицах ex vivo, то люмикан и кератокан в их нативном гликозилированном виде46все-таки способны образовывать дополнительные поперечные сшивки с коллагеном(Zhang Y. et al., 2011).Богатые лейцином протеогликаны, сшитые с коллагеном в системе in vitro,способны к защите от катаболизма ММП.

Показано, что коллагены I и IV типа,обработанные УФ-А-рибофлавином, становятся устойчивыми к действию ММП1, -2, -9 и -13 (Zhang Y. et al., 2013).Данные конфокальной микроскопии пациентов с КК после CXL указывают наполную потерю суб-базальных нервных сплетений и уменьшение количествапередних стромальных кератоцитов в раннем послеоперационном периоде (Jordan C.et al., 2014). При этом в наиболее чувствительной лимбальной зоне роговицынаблюдается существенное сокращение среднего числа жизнеспособных клеток(Vimalin J. et al., 2012) и снижается способность эпителиоцитов лимба к делению(Thorsrud A. et al., 2012).

Данные, отличные от предшествующих результатов,получены Richoz O. с соавт. Так, при CXL с УФ облучением лимбальной зоныроговицы кроликов с использованием стандартной (5,4 Дж/см2) и двукратнопревышающей плотности энергии не были выявлены признаки поврежденияэндотелия и сосудистой сети лимба. Исследователями сделан вывод о сохранениирегенераторных способностей лимбальных эпителиоцитов и паттерна экспрессииодного из маркеров клеточного цикла стволовых клеток р63 – функциональногогомолога p53, ответственного за подавление пролиферации и индукцию апоптоза(Richoz O. et al., 2014).Ещё один важный аспект действия CXL затронут Kymionis G.

с соавт.,которые указывают, что основные неблагоприятные морфологические последствияУФ сшивания коллагена у пациентов с кератэктазиями связанны с активациейапоптоза кератоцитов, наблюдаемого преимущественно к передней строме роговицыв течение первых 3 мес после процедуры (Kymionis G.D. et al., 2009). Анализстромальных компонентов после TE-CXL также указывает на потерю кератоцитов вверхней строме конусной роговицы с последующим их восстановлением (MencucciR.

et al., 2013). Через 6 мес после процедуры CXL в наружных стромальных слояхобнаруживаются как состоятельные кератоциты, содержащие большое ядро,эндоплазматический ретикулум и все другие органеллы, так и клетки без ядра и47органелл. Эпителий, базальная мембрана и слой Боумена, по данным авторов, неотличаются от таковых в норме (Akhtar S. et al., 2013).Процесс постепенного восстановления зоны усиленного клеточного апоптозавступает в наиболее активную фазу через 3 мес после процедуры (Mazzotta C. et al.,2007). Опубликованные Mencucci R. с соавт. исследования гибели клеток роговицыпоказали, что через 6 мес после рибофлавин-УФ-А индуцированного сшиванияпроисходит их репопуляция от пролиферирующих CD34-позитивных кератоцитов,которые равномерно распределяются по всей строме (Mencucci R.

et al., 2010).В отличие от предыдущих авторов Messmer E. с коллегами наблюдали упациентов с КК после CXL значительное уменьшение количества кератоцитов навсей площади роговицы в сроки до 30 мес: в центре, на периферии, особенно, впередних, и чуть менее выраженно – в средних слоях стромы при отсутствиизначимых изменений в задней строме. При этом не выявлено различий в количествестромальных клеток при использовании рибофлавина по стандартному илигипоосмолярному методу (Messmer E. et al., 2013).В кератоцитах и эндотелиальных клетках человеческих роговиц с КК послеУФ сшивания в сроки от 5 до 30 мес, наряду с отсутствием ингибитора апоптоза Bcl2, обнаружен проапоптозный белок ВАХ и антиапоптозный сурвивин (Messmer E.M.et al., 2013).