Диссертация (1174186), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В качестве анестезиологического пособия применяливнутримышечный наркоз препаратами «Кетамин» (50 мг/кг) и «Ксилазин» (ОДО«Ветфарм», Беларусь) в дозе 20 мг/кг, местные инстилляции 0,4% раствораоксибупрокаина («Инокаин», Индия). Деэпителизацию роговицы производилимикрохирургическимшпателемнаучастке,отмеченномтрепаном(илиметчиком), 3, 6 или 9 мм с помощью операционного микроскопа Carl Zeiss(Германия). Облучение проводили от выше указанного источника УФ светамощностью 3 мВт/см2, от 5 до 30 мин.УФ облучение свиных роговиц ex vivo производилось после ихдеэпителизации микрохирургическим шпателем в режимах 3 и 5 мВт/см 2продолжительностью от 1 до 30 мин.Насыщение свиных роговиц ex vivo, а также роговиц крыс и кроликов invivo рибофлавином мононуклеотидом выполняли посредством инстилляцийрастворов на поверхность деэпителизированной роговицы.
Закапывания раствораизоосмотического рибофлавина производили из расчета по 2 капли в мин,64растворов в составе с полимерами (Декстралинк, Риболинк, Хитолинк) – 1 каплякаждые 2 мин.Для насыщения использовали следующие офтальмологические растворы:- 0,1% рибофлавина мононуклеотид на изоосмотической буферной основе;- «Декстралинк» (0,1% рибофлавинамононуклеотид и 20% декстран смолекулярной массой 450-550 кДа), Россия [Рег.удостоверение №ФСР2010/09071];-«Риболинк»(0,1%рибофлавинамононуклеотидс1,0%гидроксипропилметилцеллюлозой; вязкость 2% раствора в воде при 20ºС 4000мПа·с);- «Хитолинк» (0,1% рибофлавина мононуклеотид с 1,0% хитозаномсукцинатом).В дальнейшем по тексту рибофлавина мононуклеотид указывается какрибофлавин.Забор влаги передней камеры (ВПК) кроликов производили в объемеоколо 0,2 мл через парацентез с использованием иглы 30 G (внешний диаметриглы 0,3 мм) после завершения инстилляций фотосенсибилизатора ипромывания конъюнктивальной полости стерильным физраствором.В клинические наблюдения были включены 92 пациентов (92 глаза) скератоконусом I-II стадии по классификации Амслер (Amsler M., 1946, 1961),находившихся на лечении в Уфимском НИИ глазных болезней, в т.ч.
женщинбыло 35 (38%), мужчин – 57 (62%). Средний возраст больных составил 33,77,9года. Группа контроля – 42 практически здоровых добровольца.Стандартное УФ сшивание с деэпителизацией (Epi-Off) роговицы глазапроводилось в условиях операционной. Под местной анестезией (0,4% раствороксибупрокаина–«Инокаин»,Индия),последеэпителизациироговицыдиаметром около 8-9 мм производились инстилляции раствора «Декстралинк» 1капля / 2 мин (Россия, рег. удостоверение №ФСР 2010/09071) в течение 30 мин.Состоятельностьнасыщенияроговицырибофлавиномоцениваласьполюминесценции при биомикроскопии при помощи щелевой лампы с кобальтовым65(синим) светофильтром. Для облучения роговицы использовали устройствоофтальмологическое «УФалинк» (Россия, рег. удостоверение №ФСР 2009/05489)в режиме 3 мВт/см2 и длине волны 370 нм. Общая продолжительность облучения30 мин (6 интервалов по 5 мин).
В процессе УФ облучения производилисьинстилляции раствора «Декстралинк» из расчета 1 капля / 2 мин.Трансэпителиальная техника кросслинкинга выполнялась без удаленияэпителия (Epi-On) роговицы с этапом предварительного насыщения посредствомионофореза с раствором 0,1% рибофлавина в течение 15 минут, силой тока 1,0 мАс использованием гальванизатора «Поток-1» (Россия). Этап УФ облученияроговицы был аналогичным стандартной методике.Забор слезной жидкости (СЖ) выполняли до операции и на 3, 7 и 14 сутпосле УФ сшивания. Для получения сыворотки забор венозной кровиобследуемых пациентов производили из локтевой вены в утренние часы (800 - 900),натощак. После ретракции сгустка пробы центрифугировали при 1500 об/мин втечение 10 мин.2.2. Иммунологические методы исследованияОпределение цитокинов в слезной жидкости и сыворотке крови.Определение уровня цитокинов в СЖ и СК проводили с применениемстандартных диагностических наборов методом иммуноферментного анализафирмы«Вектор-Бест»(Россия)и«eBioscience»(Австрия).Исследованосодержание в СЖ и СК пациентов с КК: фактора некроза опухоли альфа (TNF-α),интерлейкина-1 бета (IL-1β), трансформирующего фактора роста бета-1 (TGF-β1),трансформирующего фактора роста бета-2 (TGF-β2), интерферона альфа (IFN-α).Учет результатов проводили с применением иммуноферментного анализатора«Multiscan» (Финляндия) при длине волны 450 нм.
Результаты выражали в пг/мл.Количественное определение рибофлавина во влаге передней камеры глаза.Определение содержания рибофлавина в образцах ВПК глаза кроликовпроведено методом твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) сиспользованием тест-систем ID-Vit фирмы Immundiagnostik (Германия) и66автоматического ИФА-анализатора «Multiscan» при длине волны 610 нм,результат исследования выражали в μг/л.2.3. Биохимические методы исследованияОпределение ТБК-активных продуктов.ТБК-активные продукты (ТБК-ап) или ТБК-реагирующие продукты (ТБКрп) определяли с помощью набора реактивов «ТБК-АГАТ» (ООО «АГАТ-МЕД»,Россия). Метод основан на способности продуктов ПОЛ образовывать с ТБКокрашенный комплекс, экстрагируемый бутанолом. Оптическая плотностьобразовавшихся комплексов определялась фотометрически на СФ-56 (Россия) придлинах волн 535 и 570 нм.Определение супероксиддисмутазы.Определение содержания супероксиддисмутазы (СОД) в СЖ и СКвыполняли с использованием тест-набора «eBioscience» (Австрия) на фотометреStatFax (США) и TECAN INFINITE F-50 (Австрия).Определение общего антиоксидантного статуса.Оценка общего антиоксидантного статуса (ОАС) слезы и СК пациентовосуществляли с помощью тест-системы «Total antioxidant status» (RandoxLaboratories Ltd., Великобритания) на фотометре SF-Ultra (Россия).Принцип метода основан на подавлении развития окраски хроматогена втестируемой пробе пропорционально концентрации антиоксидантов.2.4.
Биофизические методы исследованияМетоды исследования биометрических и биомеханических показателейроговицы.Измерения толщины роговицы (Epi-Off и Epi-On) глаза кролика in vivoвыполняли в двух перпендикулярных меридианах на 5 участках: в центре и в 2-3мм от центра – сверху, снизу, со стороны виска и со стороны носа сиспользованием контактного пахиметра Tomey SP-100 (Япония).Толщина свиных роговиц ex vivo определялась в центральной зоне спомощью микрометра Digital linear gauge EG-100 (Япония).67Дляопределенияпрочностныхсвойствсвиныхроговицготовиликорнеальный лоскут, после деэпителизации измеряли его толщину.
Насыщениероговичных дисков рибофлавином проходило через участок лишенный эпителия втечение 30 мин с использованием исследуемых растворов (рибофлавинизоосмотический, Декстралинк, Риболинк или Хитолинк). УФ облучениекорнеального диска проводили при 370 нм, 3 мВт/см2 продолжительностью 30мин.
Затем с помощью вырубного штампа из роговиц в горизонтальноммеридиане через ее центральную зону вырезали два лоскута одинаковой ширины4 мм, измеряли их длину. Лоскуты поочередно укрепляли на зажимах ипроизводили их растяжение до полного разрыва с использованием универсальнойиспытательной машины МТ-140 с датчиком силы SBR-50L (ООО «Метротекс»,Россия),совмещеннойсперсональнымкомпьютером.Проводиливидеорегистрацию от начала растяжения до момента полного разрыва.В другой серии исследований из интактных роговиц готовили роговичные полоскишириной 4 мм, измеряли их длину.
Одну из них оставляли интактной (контроль), адругую (опыт) пропитывали исследуемыми растворами рибофлавина в течение 30мин и затем проводили стандартное УФ облучение (370 нм, 3 мВт/см2, 30 мин). Впоследующем аналогичным образом производили их растяжение до полногоразрыва.Механическуюпрочностьроговицоценивалиповеличинампоказателей разрывной нагрузки образцов на диаграмме «приложенная сила –относительное удлинение», величинам относительного удлинения и порезультатам расчета модуля Юнга.Расчет модуля модуля Юнга производили формуле:EP l0m g l0S l0S l0m - масса образца (кг),g - ускорение свободного падения (м/c2),l0 - длина образца до растяжения (мм),S - площадь поперечного сечения образца (мм2),∆l0 - приращение длины образца (мм).68Методы исследования УФ абсорбции роговицей ex vivo.Величину УФ абсорбции роговицей ex vivo оценивали по поглощению светаот диодного УФ-А излучателя (устройство «УФалинк») с длиной волны 370 нм,проходящего через изолированную роговицу, размещенную на фотоприемномэлементе устройства для определения мощности УФ-А излучения УФ-радиометр(ООО «НТП ТКА», Россия) (Рисунок 1).Рисунок 1 - Определение величины УФ абсорбции роговицей (схема).Регистрацию показаний с УФ-радиометра осуществляли через 1, 5, 10, 15,20,25,30минпослеофтальмологическогозавершенияраствораснасыщенияпомощьюиудалениясалфетки.излишковДеэпителизациюпроизводили на всей поверхности свиной роговицы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
