Диссертация (1174186), страница 15
Текст из файла (страница 15)
При расчетах степеникорнеального УФ поглощения учитывали толщину роговиц каждого образца.Хемилюминесцентный анализ.Для изучения интенсивности свободно-радикальных процессов проводилихемилюминесцентный (ХЛ) анализ ВПК кроликов, супернатантов гомогенатовроговицкроликовитканейглазногояблокакрыссиспользованиемхемилюминометра ХЛ-003 (Россия). Супернатанты от гомогенатов роговицкроликов получали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 мин.Исследовалижелезоиндуцированную(Fe+2)хемилюминесценцию по Владимирову Ю.А.
(1992).илюминолзависимую69Дляоценкижелезоиндуцированной(ЖИХЛ)илюминолзависимойхемилюминесценции (ЛЗХЛ) определяли спонтанную светимость, амплитудумедленной вспышки, светосумму свечения, выражаемые в условных единицах спомощью специализированной компьютерной программы (Фархутдинов Р.Р.,Лиховских В.А., 1995).Спектрофотометрическийанализ.Количественноеопределениерибофлавина.Количественное определение рибофлавина мононуклеотида в свинойроговице ex vivo выполняли после корнеального насыщения. Предварительнопроводили деэпителизацию роговицы диаметром ~ 9 мм, глазное яблокопомещали на подставку вогнутым сферическим основанием соответствующегоразмера с тем, чтобы поддерживался офтальмотонус и производили инстилляцииисследуемых растворов.
Затем из глазного яблока выкраивали роговичныйлоскут, который замораживали (-18ºС).Определение содержание рибофлавина мононуклеотида в роговице кроликав экспериментах in vivo проводили после внутримышечного наркоза и местнойанестезии. Метчиком выполняли разметку роговицы и на указанном участкешпателем производили деэпителизацию диаметром 8-9 мм под операционныммикроскопом Carl Zeiss (Германия). Кроликов выводили из экспериментапосредствомлетальнойпередозировкинаркоза,послечеговыполнялиэнуклеацию глазного яблока, из которого выкраивали роговичный лоскут изамораживали.Количественное определение рибофлавина мононуклеотида в свиных иликроличьих роговицах выполняли после замораживания образцов сразу посленасыщения, избегая их пребывание на свету.
Точную навеску 0,1-0,2 гкорнеальной ткани аккуратно разрезали на мелкие кусочки, помещали в ступку,добавляли пипеткой 2,5 мл раствора уксусной кислоты (0,5 мл уксусной кислотыледяной разводили водой в мерной колбе до 250 мл) и истирали с измельченнымстеклом. Прибавляли пипеткой 2,25 мл 0,1 М раствора натрия ацетата, снова70тщательно истирали. Отбирали шприцем жидкую фазу и фильтровали в кювету,используя шприцевую насадку PTFE c диметром пор 0,45 мкм.
Измерялиоптическую плотность на спектрофотометре СФ-56 («ОКБ Спектр», Россия) при445 нм (по методике ФСП 42-7969-06). Раствор сравнения – вода очищенная.Содержание рибофлавина мононуклеотида в мг/г рассчитывали по формуле:Х , МГ/Г D (4, 75 a) 1, 2709 1000 D (4, 75 a)a 323 100a 25, 415D – оптическая плотность испытуемого раствора,1%323 – удельный показатель поглощения Е1см рибофлавина при длине волны445 нм,1,2709 – коэффициент пересчета рибофлавина в рибофлавин-мононуклеотид,4,75 – объем растворителя (2,5+2,25 мл),100, 1000 – коэффициенты пересчета концентрации в мг/г,а – навеска ткани роговицы в граммах.Для разведений раствора рибофлавина мононуклеотида отклонения отобъединенного закона Бугера-Ламберта-Бера при оптической плотности винтервале 0,6-0,1 составили не более 3%.
Для расчетов количественногосодержания рибофлавина мононуклеотида использовали удельный показательпоглощения. С целью повышения достоверности,при малых количествахопределяемого вещества и оптической плотности менее 0,1 дополнительноиспользовали метод калибровочного графика.Определение оптической плотности проводили в течение 30 мин послевзвешивания, защищая пробы от продолжительного пребывания на свету.Использовали реактивы по Государственной Фармакопее XI, вып. 1.2 иXII, ч.
1.712.5. Морфологические и электронномикроскопические методыисследованияЭксперименты были проведены на 78 крысах-самцах линии Вистар весом280-320 г. Срок наблюдений – 3, 7, 14, 30, 90 сут.Распределение животных приведено в таблице 1. Для морфологическойоценки влияния УФ кросслинкинга на структуру роговицы были использованыгистологические и электронномикроскопические методы. Энуклеацию глазныхяблок крыс производили у животных, предварительно выведенных из опытапередозировкой паров эфира. По истечении 15 мин проводилась энуклеацияглазных яблок.Таблица 1 - Распределение животных в группахИсследованияГруппыживотныхЭлектронномикроскопическиеМорфологическиеМорфологическиеприжизненныеnкрысглазкрысглазкроликовглаз1Интактные(контроль)4848362УФО безрибофлавина481020363УФО + изорибофлавин481020364УФО +Декстралинк481020365УФО +Риболинк481020366УФО +Хитолинк4810203672Прижизненныеморфологическиеисследованияроговицыкроликовпроведены под внутримышечным наркозом методом конфокальной микроскопиис помощью лазерного сканирующего томографа Heidelberg Retinal TomographerHRT-III («Heidelberg Engineering», Германия) с насадкой «Rostok».Для гистологического исследования энуклеированные глазные яблокификсировали в 10% нейтральном формалине с буфером.
В дальнейшемосуществлялиобезвоживаниегистоматериалавспиртахвозрастающейконцентрации, проводку и заливку в парафин выполняли по общепринятымметодикам. Гистологические срезы толщиной 1-4 мкм готовили на ротационноммикротомеRM2145(LeicaMicrosystems,Германия),окрашивалигематоксилином-эозином, а также по методу Ван Гизона. Световая микроскопиягистологических срезов проводилась с помощью микроскопа LEICA DM 2500 сцифровой фотокамерой LEICA DFC 450 (Leica Microsystems, Германия).Для электронномикроскопическогоисследования кусочки роговицыразмерами 1×1 мм фиксировали в растворе 2% глутарового альдегида накакодилатном буфере (рH 7,2-7,4), постфиксировали в 1% растворе тетроксидаосмия на буферной основе. Обезвоживание и заливку в эпон-812 проводили пообщепринятойметодике.ультрамикротома«LeicaУльтратонкиеEMUC7»срезы(LeicaпроизводилиMicrosystems,спомощьюГермания),контрастировали цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе«JEM-1011» (Jeol, Япония).Определение изменений плотности фибриллярной упаковки коллагеновыхволокон роговицы после УФ воздействия или рибофлавин-УФ сшиванияпроводили по методу, описанному R.
Pinelli с соавт. (2009). Для этой цели всредних слоях роговицы крыс находили участки с поперечными срезамироговичных пластинок и делали микрофотографии при увеличении микроскопа×15000. Подсчитывали количество коллагеновых фибрилл на площади снимка250 000 нм2 (в квадратах со стороной 500 нм). На каждом фотоснимке определяликоличество фибрилл в 20 квадратах.732.6. Методы токсикологической оценки биологического действияофтальмологических растворов для УФ сшивания роговицыЦитотоксичность in vitro на культуре фибробластов мыши.Определение цитотоксического эффекта проводили на культуре фибробластовмыши линии NIH-3Т3 по ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские.
Оценкабиологического действия медицинских изделий». Из каждого испытуемого средстваготовили 3 пробы экстрактов. Клетки высеивали в культуральные плоскодонныепланшеты (Laboplast), инкубировали в СО2-инкубаторе Sanyo (Япония) в течение 24ч во влажной атмосфере, содержащей 51% СО2 до образования монослоя, затемвносили в культуру экстракты из растворов. Отрицательным контролем служиласреда F-12 без сыворотки, положительным – раствор цинка в азотной кислоте (Zn 1-2wt.% HNO3, разбавление 1:100 физиологическим раствором). По прошествии 24 чпосле внесения образцов экстрактов в культуру из планшета удаляли среду.Фибробласты фиксировали 0,25% глутаровым альдегидом в фосфатном буфере втечение 20 мин, добавляя по 500 мкл раствора в каждую лунку. Клетки окрашивали0,2% спиртовым раствором кристалл фиолетового, внося по 500 мкл красителя вкаждую лунку на 20 мин.
Оценивали интенсивность окрашивания клеток. Образцырастворов фотосенсибилизаторов сравнивали с отрицательным контролем. Сиспользованием светового микроскопа Leica DM1000 («Leica Microsystems»,Германия) исследовали морфологию клеток. Степень реакции клеток оценивали вбалах (Таблица 2).Таблица 2 - Шкала цитотоксичности в баллахЦитотоксичность (баллы)Интерпретация0Не цитотоксический1Легкая цитотоксичность2Средняя цитотоксичность3Значительная цитотоксичность74Лизис клеток in vitro на культуре фибробластов мыши.Параллельно с изучением цитотоксичности выполняли микроскопию дляисследования лизиса клеток.
Контроль – дистиллированная вода. Критерииклеточных характеристик представлены в таблице 3.Таблица3-Критерииклеточныххарактеристикприисследованиицитотоксичности экстрактов растворов на культуре фибробластов мышиСтепеньреакции01234РеакцияОтсутствуетНаблюденияЕдиничные внутриклеточныегранулыНе больше 20% клеток круглые,Незначительная слабо прикрепленные, безвнутриклеточных гранулНе больше 50% клеток круглые,Нерезкаяне имеющие внутриклеточныхгранулНе больше 70% монослояУмереннаясодержат круглые клеткиРезкаяПрактически полностьюразрушенный монослойНет лизисаЛизис не более20%Лизис не более50%Лизис не более70%Лизис более70%Исследования раздражающего действия in vivo на кожу.Определение раздражающего действия растворов фотосенсибилизатороввыполняли в соответствии с ГОСТ ISO 10993-10 – 2011 «Исследованияраздражающего и сенсибилизирующего действия».Эксперименты были проведены на 4 кроликах-самцах альбиносах длякаждого раствора.
Для этого участки кожи 5×5 см за день экспериментатщательно выстригли на спине справа и слева от позвоночника животного.Испытуемые растворы наносили на кожу в нативном виде из расчета 20 мг/см 2,контроль – вода дистиллированная 0,02 мл/см2, время экспозиции составляло 4 ч.По истечении этого времени нанесенный раствор удаляли теплой водой снейтральным мылом. Кожную реакцию регистрировали через 1 и 18 ч в75сравнении контрольным участком. Общая продолжительность наблюдений – 72 ч.Кожную реакцию оценивали в баллах, в последующем, рассчитывая индекспервичного раздражения.Исследования раздражающего действия in vivo на слизистую оболочку глаз.Вопытвключили4кроликанакаждыйисследуемыйраствор,соответственно.
В конъюнктивальный мешок левого глаза кроликов производилиинстилляции испытуемых растворов в количестве 0,1 мл (2 капли), правый –служил контролем. После внесения раствора на 1 мин прижимали слезно-носовойканал у внутреннего угла глаза. Проверка состояния окулярной слизистойоболочки и прозрачности роговицы проводилась посредством биомикроскопии иофтальмоскопии в течение недели.Исследования сенсибилизирующего действия in vivo (оценка кожной реакции).Исследование сенсибилизирующего действия in vivo (оценка кожнойреакции) проводилось в соответствии с ГОСТ ISO 10993-10 – 2011 «Исследованияраздражающего и сенсибилизирующего действия».На каждую исследуемую группу с опытным раствором брали 10 морскихсвинок-альбиносов, для контроля – 5. Всего 45 животных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
