Диссертация (Молекулярные и клеточные механизмы ультрафиолетового сшивания роговицы), страница 16

Предварительнопроводили внутрикожную сенсибилизацию. Шерсть на межлопаточной областиживотных за день до начала эксперимента тщательно выстригали. Всемживотным на подопытный участок вводились 3 парные внутрикожные инъекции:1) 0,1 мл смеси адъюванта Фрейнда (фирмы Difco) с 0,1 мл физраствора; 2)исследуемый раствор в дозе 0,1 мл, в контроле – физраствор; 3) исследуемыйраствор в дозе 0,1 мл с полным адъювантом Фрейнда в количестве 0,1 мл;контроль – физраствор с адъювантом.Фаза местного воздействия выполнялась через 7 сут с помощью накожныхаппликаций из испытуемых растворов с использованием кусочков марли, которыеудаляли по прошествии 48 ч. Через 14 сут проводили провокационную пробу дляопределяемых средств.

Для этого на кожу по бокам животного на 24 чнакладывали повязку с аппликациями растворов. О наличии сенсибилизации76судили по степени реакции, которую оценивали в баллах (Таблица 4), придопустимых значениях не более 1 балла.Таблица 4 - Система бальной оценки реакции кожи (по Magnusson B. и Kligman A.)Описание ответной реакцииБаллыНет видимых изменений0Дискретная или очаговая эритема1Умеренная и сплошная эритема2Интенсивная эритема и припухлость32.7. Методы статистической обработки результатовВсе числовые данные обрабатывали методом вариационной статистики,представляли в виде средней арифметической величины – M (Mean) истандартного отклонения – σ (Standard Deviation).

Для оценки достоверностинепараметрических количественных данных использовали критерий МаннаУитни, для определения достоверности нормально распределенных данных –критерий Стьюдента.Статобработку результатов проводили с помощью пакета программStatistica 6.1 и Excel 2010 по методам параметрической и непараметрическойстатистики.77ГЛАВА 3.ВЛИЯНИЕ ОФТАЛЬМОЛОГИЧЕСКИХ РАСТВОРОВ ДЛЯУФ СШИВАНИЯ РОГОВИЦЫ НА ЕЕ БИОМЕТРИЧЕСКИЕИ БИОМЕХАНИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ, ДИНАМИКУ УРОВНЯРИБОФЛАВИНА В ТКАНЯХ ГЛАЗАНастоящие исследования предприняты с целью оценки воздействиярастворов Риболинк, Хитолинк и Декстралинк на толщину роговицы ивозможность оптимального проведения роговичного УФ сшивания. Вариациилинейныхпараметровроговицы,возникающиеприиспользованииофтальмологических растворов, могут опосредовано влиять на интенсивность УФизлучения в тканях глаза.Исследования проведены в 4-х группах: в 1-ой (контроль) применялсяизоосмотичный раствор 0,1% рибофлавина, во 2-ой (контроль) – Декстралинк(0,1% рибофлавин и 20% декстран), в 3-й – Риболинк (0,1% рибофлавин и 1,0%ГПМЦ), в 4-ой – Хитолинк (0,1% рибофлавин и 1,0% хитозана сукцинат).3.1.

Динамика изменений толщины свиной роговицы глаза ex vivo приинстилляциях офтальмологических растворов рибофлавинаЭкспериментальные исследования проведены ex vivo на 32 свиныхроговицах (по 8 роговиц в каждой группе). Предварительно с корнеальнойповерхности удаляли эпителий, готовили корнеосклеральный лоскут, измерениятолщины роговицы выполняли в центральной зоне. Средняя толщина свиныхроговиц без эпителия составила 1,24±0,06 мм. Роговичный диск помещали навыпуклую стеклянную сферическую (~ 8 мм) оснастку, соответствующуюдиаметру ирадиусу роговицы.Закапыванияизоосмотическогорастворарибофлавина (1 группа) на роговичную поверхность производили – 1 раз в мин,растворов в составе с полимерами (Декстралинк, Риболинк, Хитолинк) – каждые2 мин.

Измерения выполняли в дискретные интервалы времени 5 мин в течение 30мин.Инстилляции контрольного изоосмотичного раствора рибофлавина невыявили существенных изменений корнеальной толщины на протяжении всегоэксперимента. Удаление роговичного эпителия способствовало диффузии78рибофлавина в строму, при этом статистически значимого увеличения толщиныне обнаружено (Рисунок 2).ммEpi-Off1.501.401.301.241.241.241.221.21.201.231.211.211.191.181.241.241.241.171.281.271.271.211.191.181.151.141.171.161.101.031.000.980.960.940.940.9001Рибофлавин510Декстралинк1520Риболинк2530 минХитолинкРисунок 2 - Динамика изменений толщины свиных роговиц ex vivo принасыщении офтальмологическими растворами рибофлавина для УФ сшивания.По оси абсцисс – период наблюдений (мин), по оси ординат – толщина роговицы(мм). Стрелкой отмечен этап деэпителизации (Epi-Off).Использование средства Декстралинк, всравнении с контрольнымизоосмотическим раствором рибофлавина, демонстрировалостатистическизначимое снижение толщины роговицы при инстилляциях, начиная с 10 мин (на17%, р<0,05) наблюдений.

К 30 мин эксперимента толщина роговицы составила0,94±0,08 мм, что на 24% (р<0,05) ниже исходного уровня. Уменьшениекорнеальной толщины при инстилляциях средства Декстралинк связано с79обезвоживающим действием полимера декстран, входящего в состав раствора,чтообъясняетодинизсопутствующихклиническихэффектовфотосенсибилизатора – противоотечный (Халимов А.Р. и соавт., 2018).Закапывание на роговицу раствора Риболинк не выявило достоверныхразличий толщины деэпителизированной свиной роговицы в сравнении сконтрольной группой 1 в течение всего срока регистрации (30 мин). ГПМЦ всоставе Риболинка, в отличие от декстрана, не вызывает дегидратации иуменьшения объема стромальной ткани. На 20-й мин толщина роговицы на 20%превышала значения 2-ой группы с Декстралинком.При инстилляциях средства Хитолинк в исследуемые интервалы временитакже не было обнаружено достоверной разницы в состоянии толщины роговицы,относительноконтроля(группа1).Стабильноесостояниероговицы,обработанной раствором Хитолинк в течение 30 мин наблюдений, очевидно,обусловлено инертностью биополимера, входящего в состав раствора (ХалимовА.Р.

и соавт., 2018).Таким образом, исследования толщины свиной роговицы ex vivo приинстилляциях средств Риболинк и Хитолинк не выявили статистически значимыхразличий в сравнении с контрольным раствором изоосмотичного рибофлавина,при этом изучаемые корнеальные параметры в течение 30 мин эксперимента непретерпевали существенных изменений.

В этот же срок наблюдений, начиная с 5ой мин эксперимента, раствор Декстралинк способствовал снижению толщиныроговицы, за счет дегидратации стромы.3.2. Особенности изменений толщины роговицы глаза кролика in vivoпри инстилляциях офтальмологических растворов рибофлавинаЭксперименты in vivo позволяют дать оценку возможных измененийкорнеальнойтолщинысучетомгидродинамикиитемпературы.осуществляетсяестественнаясохраняющейсяКромеэтоготрансстромальнаявприжизненнойпроцесседиффузиярибофлавина мононуклеотида в переднекамерную влагу глаза.глазнойинстилляцийгидрофильного80Отметим, что средняя толщина интактных роговиц кроликов in vivo вцентральной зоне по данным пахиметрии составляла 369±31,2 мкм, а послеудаления эпителия – 338±26,3 мкм. Измерения толщины выполняли в двухперпендикулярных меридианах на 5 участках роговицы: в центре и в 2-3 мм отцентра – сверху, снизу, с виска, с носа.Таблица 5 - Динамика толщины роговицы кролика in vivo при инстилляцияхраствора рибофлавина изоосмотического (мкм, M±σ)Участок роговицыЦентрСверхуСнизуС вискаС носаКонтроль358±15,2376±12,4372±13,3365±13,7363±19,4Epi-Off330±9,3342±16,4341±12,3330±11,5328±14,35364±13,0360±11,2358±12,5336±13,4334±16,210350±16,0355±11,1363±12,4356±13,1343±18,915360±13,1361±16,2368±19,3360±18,5355±15,920351±16,4346±12,1348±17,2350±11,9360±12,625350±17,0365±19,1355±19,0362±18,2365±16,130355±20,0369±18,1360±20,1365±13,6358±12,4Время насыщения(мин)исходное состояниестатистически значимых отличий с контролем не выявленоВлияние растворов на толщину роговицы изучалось in vivo на 24 глазах (12кроликов), по 6 глаз в каждой группе.

После анестезиологического пособияпроизводили деэпителизацию роговицы диаметром около 9 мм.Закапывания изоосмотичного раствора рибофлавина на поверхностьроговицы кролика по данным пахиметриине вызвали значимых измененийгидродинамики стромы и, соответственно, толщины деэпителизированнойроговицы в течение всего срока насыщения (30 мин) (Таблица 5).

Аналогичныерезультаты измерений были типичны для всех обследуемых зон роговицы глаза.81Следует отметить, что отмечалась слабая тенденция к увеличению толщиныроговицы (не более 9% в центре), возможно, по причине незначительной еегидратации, однако статистический анализ не подтвердил достоверностьизмерений.Таблица 6 - Динамика толщины роговицы кролика in vivo при инстилляцияхраствора Декстралинк (мкм, M±σ)Участок роговицыЦентрСверхуСнизуС вискаС носаКонтроль370±11,3384±18,2387±15,4379±12,5373±19,1Epi-Off332±11,2339±12,4341±16,8336±14,2330±14,9Время насыщения(мин)исходное состояние5322±12,2* 320±12,2* 302±12,9* 314±19,1* 308±17,8*10305±15,4*288±9,8*283±19,9* 278±16,8* 294±15,8*15284±16,0*269±9,2*273±17,3* 270±12,4* 236±19,5*20257±19,1* 262±14,3*25269±14,3* 271±16,2* 268±17,4* 258±19,2* 252±12,0*30271±9,2*270±9,5*242±13,6* 232±18,2*268±14,0* 275±17,9* 263±11,7* 260±12,3** различие с контролем (исходное состояние) статистически значимо р<0,05В группе, где использовался раствор Декстралинк, толщина центральнойзоны роговицы после удаления эпителия уменьшилась по данным пахиметриина 10,3% (38 мкм) (Таблица 6).

Уже через 5 мин после начала инстилляцийраствора регистрировалось достоверное (р<0,05) снижение корнеальнойтолщины деэпителизированной роговицы кролика на 13%. Статистическизначимое уменьшение толщины роговой оболочкина фоне препаратаДекстралинк, по сравнению с ее исходным состоянием, наблюдалось в течениевсего срока эксперимента. При этом, на 20-ой мин отмечалось наибольшееснижение корнеальной толщины (на 30% в центре роговицы, р<0,05).82Результаты пахиметрии четырех периферических участков роговицы имелианалогичную четко выраженную достоверную тенденцию к уменьшениютолщины роговой оболочки (до 38%, р<0,05), что и в центре.Применение раствора Риболинк в качестве средствадля глазныхинстилляций не выявило каких-либо особенностей изменения биометрическихпоказателей роговицы (Таблица 7).Таблица 7 - Динамика толщины роговицы кролика in vivo при насыщениираствором Риболинк (мкм, M±σ)Участок роговицыЦентрСверхуСнизуС вискаС носаКонтроль371±18,6376±14,2384±12,3380±17,5392±21,4Epi-Off342±12,4335±9,0340±13,8344±12,5352±18,15332±17,1327±9,6354±13,2341±16,4366±19,010338±18,0344±16,1361±14,1366±12,8371±12,915343±14,4337±18,2361±18,4370±13,5364±8,920334±17,2334±9,0346±15,4342±12,0349±12,125330±16,1342±14,3344±18,3351±16,0360±17,430342±9,3335±16,4335±19,4344±11,5353±13,6Время насыщения(мин)исходное состояниестатистически значимых отличий с контролем не выявленоЕе толщина в центре по данным пахиметрии после деэпителизации была на8% (29 мкм) меньше измерений интактной роговицы.