Диссертация (Лечение посттравматического остеомиелита с применением тканеинженерных конструкций), страница 7

В соответствии с размерамиможно условно выделить макропористость (а) 100–200 мкм, крупные поры (б) 10–50 мкм, мелкие поры (в) в пределах 1 мкм и нанопористость (г) 50–200 нм(Рисунки 6–8).36Рисунок 6 – КГА-матрица: а – макропористость 100–200 мкм, б – крупные порыРисунок 7 – КГА-матрица – крупные поры 10–50 мкмРисунок 8 – КГА-матрица, нанопористость 50–200 нм372.3.

Методики изучения примененного костно-пластическогоматериала «КГА-матрица» на экспериментальных моделяхВнастоящеематериаловвремяразработандляизученияразличныхцелыйкомплекстехнологий,костно-пластическихвтомчислеиэкспериментальных. Учитывая характеристики «КГА-матрицы» была выбрананаиболее оптимальная для этой цели имплантация в дефект костной ткана.2.3.1. Методика имплантации «КГА-матрица» в неосложненный дефекткостей черепа in vivoЭкспериментальнаяоценкаостеогеннойактивности«КГА-матрицы»изучали на модели дефекта костей черепа с последующим замещениемсформировавшихся дефектов, материалом на основе коллаген-апатитовойматрицы с параллельным контролем.Оценка остеогенности материала выполнена на самцах крыс (n = 20) породы«Вистар», массой 280–350 граммов.

Крысам под внутримышечным наркозомрастворами Zooxylasin и Zoletil 100 проводили удаление шерсти в проекциитеменных костей на длину кожного разреза. Затем после 2-кратной обработки70%-м спиртовым раствором осуществляли разрез кожного покрова до 2 см.Далее атравматично разводили мягкие ткани до теменных костей и формировалидва отверстия в костях черепа круглой фрезой диаметром 3,5 мм (Рисунок 9).Рисунок 9 – Схема нанесения дефектов (3,5 мм) в теменных костях крысыкруглой фрезой38После чего один из дефектов (опытный) закрывали заранее приготовленнымтрансплантатом, выполненным на основе «КГА-матрицы», в то время какконтрольный оставляли свободным.

На данной модели были изучены реакции награнице трансплантата и костной ткани, а также минерализация трансплантатов.С этой целью использовали компьютерную томографию (Simens SOMATOMDefinition AS, Германия), гистологические препараты костей черепа.Для изучения остеокондуктивных и остеоиндуктивных свойств материалаприжизненновыполняликомпьютернуютомографию.Послевыведенияживотных из эксперимента проводили замеры дефектов и изготавливалигистологические препараты (Рисунок 11).абвРисунок 11 – КТ и подготовка теменных костей черепа крысы с опытным иконтрольным дефектом перед помещением в гистологический блок (а, б, в)2.3.2.

Методика ортотопической имплантации «КГА-матрицы» вмодели посттравматического остеомиелита in vivoНамипроведеномоделированиепосттравматическогоостеомиелитабольшеберцовой кости с последующим замещением сформировавшегося дефектаразработанным материалом «КГА-матрица». Исследование проводилось насамцах крыс (n = 10) породы «Вистар», массой 280–350 граммов. По известнойметодике под внутримышечным наркозом растворами Zooxylasin и Zoletil 100 вдистальном отделе большеберцовой кости сверлом 2 мм формировали дефекткортикального слоя. Далее в сформированный костный дефект вводили 0,1 млсуспензии Staphylococcus aureus в количестве 104.

К 5-м суткам у животныхразвивалась свищевая форма посттравматического остеомиелита (Рисунок 11).39Рисунок 11 – Внешний вид конечности с функционирующим свищевым ходомПосле формирования свища и выделения гноя из раны, осуществлялирадикальную резекцию измененных тканей с одномоментной пластикой костногодефекта «КГА-матрицей» (Рисунок 12).вгабРисунок 12 – а – свищевой ход; б – посттравматический остеомиелитическийдефект; в –замещение костного дефекта КГА матрицей; г – глухие швы на кожу собработкой аэрозольным антисептикомВ опытной группе животных, для пластики остеомиелитического дефектаиспользовали трансплантат на основе «КГА-матрицы», в который интегрировалипролонгированный антибиотик Бицилин-5, как пролонгированный и наиболеечувствительный к Staphylococcus aureus.

Интегрирование антибиотика в материалосуществляли диффузным способом с последующей лиофильной сушкой.Контроль насыщения проводили взвешиванием образцов.40В контрольной группе использовали базовый материал «КГА дефектов сцелью антибактериальной терапии применяли антибиотики Бицилин-5 в видевнутримышечных инъекций (60000 ЕД) однократно.

Животных выводили изэксперимента на 30-е сутки после пластики остеомиелитического дефекта.2.3.3. Определение цитотоксичности разработанного материала «КГАматрицы» на клеточных культурахС целью изучения биосовместимости материала «КГА-матрицы» ипроверки цитотоксичности образцы материала нарезали на фрагменты размером1515 мм и помешали в чашку Петри диаметром 35 мм2. Поверхностьисследуемого образца покрывали питательной средой для роста клеток (90%-йпитательной среды ДМЕМ (Биолот, Россия) и 10%-й эмбриональной сывороткикрупного рогатого скота (Gibco, США). Чашки Петри с образцами материалапомещали в CO2-инкубатор Binder CB 150 (Binder, Germany) для пропиткиобразца питательной средой на 12 часов при 37 °C и 5% CO2.Через 12 часов производили посев клеток линии L 929 (фибробластыэмбриона мыши) в концентрации 2,5104 клеток на см2 поверхности образца.Инкубацию клеток на поверхности экспериментальных образцов проводили втечение 48 часов в условиях 37°C и 5% CO2 в атмосфере.После 48 часов инкубации образцы «КГА-матрицы» материала изымали изчашек Петри, отмывали с помощью 150 мМ раствора хлорида натрия(изотонический раствор) (Биолот, Россия) с 25 мМ буферного раствора Hepes(Sigma, США), затем окрашивали клетки на поверхности «КГА-матрицы» спомощью флуоресцентных зондов Hoechst 33342 (проникает через мембраныживых клеток) и этидиум бромидом (не проникает через мембраны живых клеток)(Sigma, США).Анализсоотношенияживыхипогибшихклетокпроводилисиспользованием конфокальной микроскопической системы Leica TCS SP5 (Leica,Germany) (Рисунок 13).41Рисунок 13 – Конфокальная микроскопия разработанного материала,флуоресцентная окраска ядерными зондами Hoechst 33342 и этидиум бромидом Н2.4.

Лучевые методы оценки интеграции «КГА-матрицы»На сроках 1, 4, 8 недель экспериментальным животным после введения 0,25мл Zoletil 100 и погружения животного в сон, прижизненно проводилоськомпьтерно-томографическое исследование (КТ) на аппарате фирмы SimensSOMATOM Definition AS (Германия) с разрешением kB 120 mas 36, толщинасрезов 0,4 мм. Оценивались размеры, распределение плотности тканей в объемеконтрольного и опытного дефектов (Рисунок 14.)Рисунок 14 – Замер опытных и контрольных дефектовс денситометрическими показателямиНа том же аппарате выполнена сравнительная оценка средних значенийплотности по шкале Хаунсфилда. Шкала была предложена сэром Годфри42Ньюболдом Хаунсфилдом, который являлся одним из разработчиков и главныхинженеров аксиальной компьютерной томографии за разработку которой вместе сАлланом Маклеодом Кормаком он получил в Нобелевской премии по физиологиии медицине.

КТ-аппараты были первыми устройствами, которые даваливозможность детальной визуализации в трехмерном виде анатомии живыхсуществ. Развитие компьютерной технологии дало возможность разработки сначала 1990-х годов программного обеспечения для 3D-реконструкции. Такоеизображение более информативно по отношению к обычным рентгеновскимснимкам, отражающим только проекции сложных анатомических структур, тоесть их суммационную рентгеновскую тень.

Была введена шкала линейногоослабления излучения по отношению к дистиллированной воде, рентгеновскаяплотность которой (при стандартных температуре и давлении) была взята вкачестве нулевой отметки 0 HU, названная шкалой единиц Хаунсфилда(денситометрических показателей, англ. HU). Таким образом, одна единицаХаунсфилда соответствует 0,1% разницы в ослаблении излучения междувоздухом и водой, это примерно 0,1% коэффициента ослабления воды, потомучто коэффициент ослабления воздуха практически нулевой что представлено вТаблице 2.Таблица 2 – Средние денситометрические показателиВеществоHUВоздух−1000Жир−120Вода0Мягкие ткани+40Кости+400 и вышеПроведена оценка значений плотности сигнала, определены размерыдефектов.432.5. Гистологический методМатериал для гистологического исследования по оценке остеогеннойэфективности имплантированного материала забирали на сроках 1, 4 и 8 недельпосле заполнения дефекта костей черепа.

Срезы получали на криотоме ShandonCRYOTOME 620E, (Thermo FisherSci., USA). Образцы заливали заливочнойсредой O. С. T. Compound Tissue Tek, Sakura, Japan. Затем делали криосрезытолщиной 11 мкм. Полученные образцы переносили на предметные стекла ирасправляли на нагревательном столике OTS 40 (Medite, Germany) притемпературе 40 °С в течение 1 минуты. Криосрезы окрашивали стандартнымиметодами – гематоксилином Джилла и эозином, ПЛК (Россия). Так жепроизводили окраску Ван-Гизона в пикриновой кислоте. Микрофотографииокрашенных препаратов делали используя микроскоп Leica DM6000 B, (LeicaMicrosystems, Germany).

Гистологическое исследование проводилось на базеинститута биофизики РАН (ИБК РАН), в лаборатории тканевой инженерииИнститута теоретической и экспериментальной биофизики РАН (ИТЭБ РАН), г.Пущино.2.6. Микробиологический метод исследованияС целью микробиологического определения инфекционного агента изостеомиелитического очага пациента высевали бактериальный образец наагаризованную питательную среду LB (Difco, BD) и помещали в термостат на37 оC до образования отдельных колоний бактерий. Полученную бактериальнуюколонию высевали в жидкую питательную среду LB (Difco, BD) и выращивалипри 37 оС 15ч. Суспензию клеток центрифугировали при 8 тыс. оборотов.ПолученнуюбиомассуиспользовалидлявыделениягеномнойДНК.Хромосомную ДНК из бактериальных клеток выделяли с помощью набораFungal/Bacterial DNA MimiPrep (Zymo Researc, USA).Для таксономической идентификации бактерий использовали метод,основанный на сходстве гена кодирующий 16S рРНК.