Диссертация (Лечение посттравматического остеомиелита с применением тканеинженерных конструкций), страница 6

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯДиссертационное исследование включало в себя три раздела. Первый итретий ее раздел являются клиническими, а второй раздел представляетэкспериментальное исследование с лабораторными животными.В первом разделе нами был проведен анализ историй болезней 210 больныхс посттравматическим остеомиелитом, лечившихся в ГКБ № 59, ГКБ № 68 иДорожной Клинической Больнице Семашко на станции Люблино ОАО «РЖД» впериод с 2009 по 2012 гг.Второй раздел представляла собой экспериментальное исследование набелых крысах (порода Вистар), клеточной культуре фибробластов, проведенное вИнститут теоретической и экспериментальной биофизики Российской академиинаук г.

Пущино.Третий раздел описывает клиническое применение разработанного способалечения посттравматического остеомиелита на базе Дорожной клиническойбольницы Н. А. Семашко на станции Люблино ОАО «РЖД».2.1. Способ получения коллаген-гидроксил апатитового биокомпозитаСотрудниками кафедры травматологии, ортопедии и ВПХ МГМСУ им.А. И. Евдокимова под руководством проф. Склянчука Е. Д. совместно синститутом биохимической физики им. Эммануэля РАН (доц. Горшенев В.

Н.)разработан способ получения коллаген-апатитового материала-биокомпозита(патент RU 2482880), который мы применили в исследовании. Технология егополучения включает синтез гидроксиапатита на гидрогелевой коллагеновойматрицеисшивкуволоконколлагена,которыйосуществляютвгидродинамическом диспергаторе роторно-пульсационного типа в процессепоследовательной загрузки компонентов, а также разлив в форму и лиофильнуюсушку готового биокомпозита. Рабочее название материала было выбрано «КГАматрица». Образовано заглавными буквами коллаген гидроксил апатит. На первойстадии загружали дробленую обезжиренную свиную кожу и подготовленную31воду и обрабатывали при гидромодуле 4–5 в течение 25–35 мин и температуре невыше 81 °C до получения гидрогеля коллагена.

Затем, не прерывая процесса, вдиспергатор загружали порошок фосфата кальция моногидрата в количестве 4,5–5,0 М и обрабатывали в течение 8–12 мин при температуре не выше 71 °C, и вдиспергатор дробно вводили 3,0–3,3 М гидроксида кальция, суспендированного в1–2 л воды, и обрабатывали в течение 25–35 мин при температуре не выше 77 °С.Сшивку волокон коллагена проводили при гидромодуле 20–25, температуре 55–56 °C в течение 90–120 мин. Далее полученную пульпу разливали в форму иподвергали лиофильной сушке при температуре коллектора -50 °C. Техническийрезультат состоял в получении дисперсии гидроксиапатита в коллагеновомгидрогеле с экспоненциальным распределением твердых фракций размером отменее 0,05 мкм до 1,0 мкм.При этом число оборотов ротора в диспергаторе на втором этапе составляло0,8–0,85 от рабочего числа оборотов остальных этапов.

Свиную шкуру передзагрузкой термически обрабатывали при температуре 38–40 °C в течение 5–10мин.Немаловажнымявлялсяпроцессподготовкиводы.Ееподвергалимикрофильтрации через фильтры с размером пор 20–30 мкм при температуре 16–20 °C и давлении 0,1–0,2 Мпа. Далее отстаивали в присутствие ионов серебра втечение не менее двух часов до дозы серебра 0,03–0,05 мг/дм3 и стерилизовали наультра фильтрационных элементах с размером пор 0,01–0,07 мкм.Для получения необходимого материала дополнительно загружали порошоксухой ламинарии с размером частиц до 5 мкм в количестве 0,05–0,10% впересчете на сухую массу дозируемого биокомпозита.Особенность примененного способа является использование в качествереактора аппарата роторно-пульсационного типа (РПА).

Это устройство сочетаетв себе принципы работы диспергатора, гомогенизатора и центробежного насоса.Благодаря конструктивным характеристикам установки РПА жидкотекучие средыв зоне обработки подвергали комплексному механоакустическому и тепловомувоздействию за счет больших градиентов скоростей, вихреобразования и32высокочастотных пульсаций в ультразвуковом диапазоне частот (Рисунок 3). Длязадания заданных температурных воздействий на пульпу устройство содержитконтур регулирования и холодильник для отвода тепла. Последовательностьзагрузки компонентов, их состав и время обработки лежат в рекомендованныхинтервалах.Рисунок 3 – Внешний вид аппарата роторно-пульсационного типа с двигателемВажным этапом являлся выбор источника коллагена. Для этих целей лучшеиспользовать дробленую обезжиренную свиную кожу, которую предварительнобланшировали в воде при температуре 38–40 °C в течение 5–10 мин.

Свинуюкожу промывали и обрабатывали оксидом кальция, что размягчало коллагенперед его превращением гидролизат коллагена. Полученный гидролизатколлагена имел тягучую консистенцию и светло-жёлтый цвет. Более 20%полученной массы составляют аминокислоты.На заключительной стадии загрузки в РПА вводили пентагидроксифлавондигидрокверцетин, известный как «Таксифолин» (Taxifolin), который относится кантиоксидантам натурального происхождения, или биофлавоноидам. Он обладаетмощным противовоспалительным и антигистаминным свойством, укрепляет ивосстанавливает соединительную ткань, потенцирует многие биоактивныевещества (витамина С и витамина Е); укрепляет сосуды и капилляры, улучшаетмикроциркуляцию крови, препятствует образованию тромбов. Добавлениепорошка сухой ламинарии с размером частиц до 5 мкм, как источника альгинатов,обеспечиваетулучшениепроцессоврегенерациитканей,обладает33кровеостанавливающими свойствами, создает мощный барьер для раневойинфекции.Протокол производственного процесса:Первая стадия.

В РПА при рабочем числе оборотов 3000 об/мин загружалипредварительно бланшированную при температуре 40 °C в течение 10 миндробленую обезжиренную свиную кожу и подготовленную воду. Продуктобрабатывали при гидромодуле 4,5 в течение 30 мин, при этом контролируюттемпературу продукта (не выше 81 °C).Вторая стадия. В полученный гидрогель коллагена, не прерывая процессав РПА, загружали порошок фосфата кальция моногидрата CaHPO4·H2O вколичестве 4,5 М и обрабатывали при температуре 61 °C в течение 10 мин припониженном числе оборотов (2500 об/мин).На третьей стадии в РПА дробно вводили 3,0 М гидроксида кальцияCa(OH)2·2Н2О, суспендированного в 1 л воды, и обрабатывали в течение 30 минпри числе оборотов 3000 об/мин и температуре не выше 77 °C.На последней четвертой стадии в РПА при рабочем числе оборотов (3000об/мин) проводили сшивку волокон коллагена при гидромодуле 20, температуре55–56 °C в течение 90 мин.

Затем полученный гелеобразный продукт разливают взаданные формы и подвергают лиофильной сушке в течение 32 ч при температуреколлектора -50 °C.Согласно данным анализа зольных элементов, проведенного на лазерноммасс-спектрометре «ЭМАЛ-2», атомное соотношение фосфор-кальций составляет0,6:1,0, что соответствует брутто-формуле Ca10H2O26P6.Параметры пористой структуры определены из изотермы адсорбции паровазота при температуре -196 °C на автоматической вакуумной адсорбционнойустановке «GRAVIMAT-4303».

SБЭТ составлял 79 м2/г.Размеры частиц твердых фракций определялись на фотоденсиметре ФСХ-5.Полидисперсность характеризуется интервалом 0,5–10 мкм, с вероятнейшимразмером частиц 0,5 мкм.34Данныйспособпозволяетполучатьколлаген-гидроксиапатитовыебиокомпозиты высокого качества, существенно упростить технологию процесса,сделать его менее затратным и дешевым в производстве.2.2. Физико-химическая характеристика свойстваразработанного пористого биокомпозитного материалаОпределениедеформационно-прочностныхсвойствобразцов«КГА-матрицы» проводили на испытательной машине (LoYD INSTRUMENT LRX plus.)Элементарный анализ выполнили на приборе ARL ADVANT'X IntelliPower.Таблица 1 – Результаты элементного анализа синтезированного гидроксиапатитаЭлемент% атомные% массовыеP13,938518,1586O61,707741,5188Ca23,661839,8805Как видно из Таблицы 1, основными элементами, составляющимисинтезированный гидроксиапатит, являются: кислород, фосфор и кальций.Полученные данные удовлетворительно совпадают с расчетными даннымидля брутто-формулы Ca10P6O26H2: P 18,4987 (± 2)%, Ca 39,893 (± 4)%.

Плотность«КГА-матрицы» материала составляет 0,2 г/см3 с содержанием гидроксиапатита60 масс. %. Биокомпозит нейтрален по pH, при изготовлении легко формуется.После лиофильной сушки готовый образец представляет собой материал белогоцвета с пористой поверхностью (Рисунок 4).35Рисунок 4 – Внешний вид «КГА-матрицы»Материал «КГА-матрица» является гидрофильным, при хранении в воде до10 дней он превращается в желеобразную текучую массу. Для борьбы с излишнейгидрофильностью образцы дополнительно модифицировали 5%-м растворомглутарового альдегида.

В результате образования сшивки между коллагеновымиволокнами «КГА-матрица» приобретает устойчивость в воде, хорошо сохраняетсвою форму и структуру, не лишаясь гидрофильных свойств. В сухом видематериал имеет прочность на сжатие 2 МПа и значительную величину разрывнойдеформации ε,% = 65. В водной среде с течением времени становится эластичными снижает прочность на сжатие до 0,5 МПа (Рисунок 5). Нелинейный характеркривой деформации биокомпозита можно объяснить сжатием перегородокпористого материала по мере увеличения на него нагрузки.Рисунок5–Деформационно-прочностныезависимостидляобразцовбиокомпозита сшитого глутаровым альдегидом на сжатие до (А) и посленасыщения водой (Б)Поверхность«КГА-матрицы»приэлектронноймикроскопииимеетсложную структурно-рельефную организацию.