Диссертация (Влияние синтетических ноотропных средств на активность металлозависимых протеиназ), страница 5

Существует в виде 2 изоформ: соматической (Mr 170000) ирепродуктивной (Mr 170000), обнаруженной в семенной жидкости некоторыхмлекопитающих [111,113].Фермент локализован в эндотелии сосудов, в эпителии органов синтенсивным водно-минеральным обменом (почечные канальца, цилиарноетелоглаза,слизистаякишечника),нервнойткани,клеткахкрови26мононуклеарногосемейства(лимфоциты,моноциты,макрофаги),репродуктивных органах [17, 27, 35].Растворимаяформаобнаруживаетсявплазмекрови,лимфе,спинномозговой, внутриглазной, слезной жидкостях [18, 19,20].Растворимаяформа образуется двумя путями: либо освобождением путем ограниченногопротеолизасекретазойизмембраносвязаннойформы,либопутемнепосредственной трансляции с mRNA, кодирующей изоформу ПДПА безтрансмембранного гидрофобного участка [21, 22].Ренин-ангиотензиновая система, компонентом которой являетсяПДПА обнаружена в нервной системе [128].

Встречается в аксонах и телахнейронов, базальных ганглиях, гипофизе, черной субстанции [113,147].ПДПА, отщепляя дипептид с С-конца ангиотензина I, катализируетобразование ангиотензина II, являющегося мощным вазопрессором [146, 160,178, 223]. Участвует в процессинге лей- и мет-энкефалинов [211]. Участвуетв деградации нейротензина, нейрокининов, энкефалинов, субстанций P и K,холецистокинина,гастрина,вазопрессина,брадикинина,окситоцина,неокиоторфина с образованием киоторфина [17, 27, 29, 113, 146, 160, 178].Установлено, что ПДПА является не только центральным связующим звеномкалликреин-кининовойиренин-ангиотензиновойсистем,регулируетсосудистый тонус, активность иммунной системы, но и принимает участие вдеградации некоторых нейромедиаторов, ответ организма на воздействиестрессирующих факторов [28, 47, 109,111, 113,146, 160, 161, 214, 223].Еще одной металлозависимой протеиназой, играющей важнуюбиологическую роль, служит такой фермент, как лизинкарбоксипептидаза.Лизинкарбоксипептидаза (EC 3.4.17.3., ЛКП, carboxypeptidaseN;argininecarboxypeptidase;plasmacarboxypeptidaseB;kininaseIa;kininaseI;anaphylatoxininactivator;creatinekinaseconversionfactor;hippuryllysinehydrolase;bradykinase;bradykinin-decomposingenzyme;protaminase; CPaseN; creatininekinaseconvertase; peptidyl-L-lysine(-L-arginine)hydrolase; CPN) – открыта в 1962 году, как фермент, участвующий в27деградации брадикинина и первоначально назван кининаза I [114].Представляет собой Zn2+-зависимую металлопротеиназу, отщепляющуюостатки основных аминокислот (лиз-, арг-) с С-конца большого количествабиологически-активныхпептидовибелков[154,176,219,220].Синтезируется печенью и выделяется в кровь [153].ЛКП – тетрамерныйбелок, Mr 280 кДа с плазменной концентрацией около 100нМ [112, 164, 193,218, 219].В молекуле присутствуют две каталитические субъединицы (Mr 4855 кДа) и две регуляторные (Mr 83 кДа), причем каталитическиесубъединицы негликозилированы, регуляторные - гликозилированы [164,192, 193, 218, 221].Ингибиторы протамина снижают активность ЛКП науровнерегуляторнойсубъединицы[219,229].ЛКП–постоянноприсутствующий в активной форме фермент, играющий ключевую роль винактивации циркулирующих кининов, анафилотоксинов, энкефалинов,опиоидных пептидов.

[93, 112, 114, 163, 171]. В качестве эндогенногосубстрата так же может выступать эпидермальный фактор роста [177].ЛКПспособна элиминировать остаток лизина фактора SDF-1α, модификациякоторого приводит к уменьшению способности этого хемокина выступать вроли пре-В-клеточного хемоаттрактанта [105, 106].Люди с врожденно низкой активностью ЛКП проявляли склонность кразвитию рецидивирующих отеков Квинке, что по-видимому связано сповышенным уровнем кининов всвязи с недостаточной скоростью ихинактивации [175].

Исследования таких людей показали сдвиг рамкисчитыванияэкзонаДНК,отвечающегозакодированиеоднойизкаталитических единиц, с чем по-видимому и связана пониженнаяактивность ЛКП [97]. ЛКП участвует в модулировании активности системыфибринолиза посредством регуляции активности плазминогена.

ЛКПспособна отщеплять С-концевой остаток лизина плазминогена, что повышаетактивность последнего до 1000 раз [148, 202, 205, 206]. Известно, чтоактивность ЛКП чувствительна к действию сериновых протеиназ [164,28203,204]. До настоящего времени все возможные функции ЛКП не выяснены[149].29ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1 Материалы исследованияЭксперимент выполнен на 144 самцах белых беспородных крысвозрастом 3 месяца и массой 250-300 г.

(рисунок 4, 5). Животныесодержались в стандартных условиях вивария. Для изучения однократноговлияния ноотропных лекарственных средств на активность КПЕ, ПДПА иЛКП пирацетам вводили внутрибрюшинно в дозе 300 мг/кг, фенотропил вдозе 100 мг/кг, ноопепт в дозе 10 мг/кг. Контрольные животные получалиэквивалентный объем физраствора. Крыс выводили из эксперимента через0,5, 4, 24 и 72 часа после последней инъекции путем декапитации (16исследуемых групп, в каждой из которых насчитывалось 6 животных).

Дляизучениядлительногодействияноотропов,препаратывводиливышеописанным режимом каждые 24 часа в течение 14 суток. Животныхдекапитировали через 24 и 72 часа после последней инъекции (8исследуемых групп по 6 животных). После декапитации собирали кровьживотных,гипоталамус,дальнейшиеизвлекалигипофиз,гиппокамп,процедуры,четверохолмие,амигдалу,еслинестриатумоговоренопродолговатыйинадпочечники.иного,проводилимозг,Всепритемпературе 30С.

Кровь подвергали центрифугированию (1000 g, 20 мин) иотбирали сыворотку. Прочие ткани погружали в физиологический раствор,охлажденный до 30С, после чего тщательно очищали их от оболочек икровеносных сосудов. Для определения активности ферментов образцытканей взвешивали, гомогенизировали в 10 мМ натрий-ацетатном буфере (pH5,6), содержащем 50 мМ хлорида натрия в соотношении 1:100 (вес/объем). Вработе использованы ацетат натрия (“Merck”, Германия), трис-HCl (“Serva”,США), GEMSA (“Serva”, США), в качестве субстрата для определенияактивности КПЕ использовали и дансил-фен-лей-арг, для определенияактивности ПДПА использовали карбобензокси-гли-гли-арг, для определения30Интактные животныеN=96Введение ноопепта (10 мг/кг)Введение физраствора (контрольная группа)N=6N=6N=6Декапитациячерез 0,5часапосле инъекцииN=6N=6N=6N=6N=6Декапитациячерез 4 часапосле инъекцииДекапитациячерез 24 часапосле инъекцииДекапитациячерез 72 часапосле инъекцииОпределение активности металлозависимых протеиназДекапитациячерез 0,5часапосле инъекцииN=6N=6Декапитациячерез 4 часапосле инъекцииДекапитациячерез 24 часапосле инъекцииДекапитациячерез 72 часапосле инъекцииN=6N=6N=6N=6N=6N=6Введение пирацетама (300 мг/кг)Введение фенотропила (100 мг/кг)Интактные животныеРис.

4. - Схема эксперимента. Определение однократного влияния ноотропов на активность металлозависимыхпротеиназ31Интактные животныеN=48Введение ноопепта (10 мг/кг)Введение физраствора (контрольная группа)N=6N=6N=6N=6Декапитация через 24 часа послезаключительной инъекцииДекапитация через 72 часа послезаключительной инъекцииОпределение активности металлозависимых протеиназДекапитация через 72 часа послезаключительной инъекцииДекапитация через 24 часа послезаключительной инъекцииN=6N=6N=6N=6Введение пирацетама (300 мг/кг)Введение фенотропила (100 мг/кг)Интактные животныеРис. 5. - Схема эксперимента. Определение длительного влияния ноотропов на активность металлозависимых протеиназ32активности ЛКП использовали N-Гиппурил-L-аргинин (“Bachem AG”,Германия).Использованыноотропныепрепараты:пирацетам(ПАО«Фармстандарт»), фенотропил (ОАО «Валента Фарм»), ноопепт (ПАО«Фармстандарт»).Всеостальныереактивыбылиотечественногопроизводства с квалификацией «ХЧ» и «ОСЧ».2.2.

Методы определения активности металлозависимых протеиназАктивность карбоксипептидазы Е определяли методом SupattaponeS.et.al [228]. Для определения активности фермента к 150 мкл (опытная проба)или 140 мкл (контрольная проба) 50 мМ натрий-ацетатного буфера,содержащего 50 мМ NaCl (рН 5,6), добавляли 50 мкл гомогената ткани. Вконтрольные пробы добавляли 10 мкл 25 мкМ водного раствора GEMSA.Пробы преинкубировались 8 мин при 370С. Реакцию начинали прибавлением50 мкл 210 мкМ дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечнаяконцентрация в реакционной смеси составляла 42 мкМ), предварительнонагретого до 37°С. Далее пробы инкубировали 60 мин при 37 0С. Реакциюостанавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора соляной кислоты.Для экстракции продукта реакции – дансил-фен-ала – к пробамприливали 1,5 мл хлороформа и интенсивно встряхивали их в течение 3минут.Дляразделенияхлороформнойиводнойфазпробыцентрифугировали 10 мин при 1000 об/мин.

Проводили измерениефлюоресценции хлороформной фазы в кювете с длиной оптического путиравной 10 мм при ex=360 нм и em=530 нм. В качестве стандартаиспользовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе. Белокопределяли методом Лоури [165].Активность КПЕ определяли как разность в накоплении продуктареакции в пробах, не содержащих и содержащих GEMSA, и выражали в33нмоль образовавшегося продукта реакции за 1 мин инкубации в пересчете на1 мг белка.Активность ПДПА определяли по образованию продуктов гидролизакарбобензокси-гли-гли-агр при рН 7,6 как активность, ингибируемуюкаптоприлом.Для определения активности ПДПА к 40 мкл гомогената ткани илисыворотки крови добавляли 20 мкл 35 мкМ каптоприла, приготовленногона100 мМ Трис-НСl буфере (рН 7,6) (контрольная проба) или 20 мкл 100 мМТрис-НСl буфера (рН 7,6) (опытная проба).

Пробы преинкубировали 8 минпри 370С. Реакцию начинали прибавлением 10 мкл раствора карбобензоксигли-гли-агр, приготовленного на 100 мМ Трис-НСl буфере (рН 7,6). Конечнаяконцентрация субстрата в пробе 5 мМ. Пробы инкубировали при 37 0С втечение 120 минут. Реакцию останавливали внесением в прбы 30 мкл 10%трихлоруксусной кислоты. Далее образцы центрифугировали (4000 об/мин,30 мин), отбирали 50 мкл надосадочной жидкости и определяли количествообразовавшегося гли-арг нингидриновым методом [139]. Белок определялиметодом Лоури [165].Активность ПДПА определяли как разность в накоплении продуктареакции в пробах, не содержащих и содержащих каптоприл, и выражали внмоль образовавшегося продукта реакции за 1 мин инкубации в пересчете на1 мг белка.Активность ПДПА определяли по образованию продуктов гидролизагиппурил-аргинина при рН 7,6 как активность, активируемую Co2+.Для определения активности ЛКП к 40 мкл сыворотки крови добавляли20 мкл 3,5 мМ CoSO4, приготовленного на100 мМ Трис-НСl буфере (рН 7,6)(контрольная проба) или 20 мкл 100 мМ Трис-НСl буфера (рН 7,6) (опытнаяпроба).