Диссертация (Взаимоотношения геномной ДНК и липидов - влияние факторов окружающей среды), страница 14

Оставляют при комнатной температуре, послеотстаивания и расслоения смеси через 20‒30 мин осторожно отбираютверхний гептановый слой, в котором измеряют D233 (Валеева и др., 2008б).Измеряют оптическую плотность при длине волны 233 нм против контроля.В качестве контроля используют образец, содержащий вместо плазмы крови0,2 мл дистиллированной воды и подвергнутый всем вышеперечисленнымвидам обработки (Валеева и др., 2008б).Гидроперекиси липидов рассчитывают в относительных единицах на1 мл плазмы крови, учитывая молярный коэффициент экстинкции:∆D233 = (D233∙Vэ)/Vn=20∙D233где D233 ‒ измеренное значение оптической плотности, Vэ=4 мл ‒ конечныйобъем гептанового экстракта, Vn=0,2 мл ‒ объем взятой плазмы крови.Нормальные величины ‒ показатели интактных или контрольныхживотных (Бергельсон и др., 1981; Валеева и др., 2008б).2.2.5.2.

Диеновые конъюгаты ненасыщенных высших жирных кислотв гомогенатах органов крысВ ходе перекисного окисления на стадии образования свободныхрадикалов в молекулах полиненасыщенных высших жирных кислотвозникает система сопряженных двойных связей, что сопровождаетсяпоявлением нового максимума в спектре поглощения ‒ λмакс = 233 нм;έ = 2,2·10-5 М-1·см-1 (Валеева и др., 2008б).Пробы к анализу готовят следующим образом: навеску гомогенатаголовного мозга, сердца, печени, почек, надпочечников, селезенки и тимусапо 500 мг отмывают от крови в 0,9%-ном растворе хлорида натрия,замораживают в жидком азоте, тщательно размельчают в охлажденнойфарфоровой ступке и добавляют 5 мл экстрагирующей смеси гептана сизопропиловым спиртом в объемном отношении 1:1. Полученную суспензию78переносят в стеклянные центрифужные пробирки, плотно закрывают ихпробками, чтобы избежать испарения экстрагирующей смеси во времяцентрифугирования.Пробыцентрифугируют10минсоскоростью3000 об/мин (Валеева и др., 2008б).Надосадочную фракцию переносят в мерные пробирки и добавляют1/10 объема дистиллированной воды.

Тщательно встряхивают, через10‒15 мин отсасывают гептановую фазу 0,5 мл и добавляют этиловый спиртв объемном отношении 1:5 (Валеева и др., 2008б).Оптическую плотность проб измеряют на СФ при 233 нм в кварцевыхкюветах. В качестве контроля используют пробы, содержащие толькоэкстрагирующую фазу (Валеева и др., 2008б).Содержание диеновых конъюгатов в пробе рассчитывают, исходя извеличины молярного коэффициента экстинкции при 233 нм для сопряженныхдиенов полиненасыщенных высших жирных кислот, равного 2,2·105 см-1·М-1,с учетом величины навески. Диеновые коньюгаты высших жирных кислот втканях выражают в мкМ/кг.

Нормальные величины ‒ показатели интактныхили контрольных животных (Валеева и др., 2008б).2.2.5.3. Малоновый диальдегид (ТБК-активные соединения) в осадкелипопротеидов плазмы кровиМалоновый диальдегид при высокой температуре в кислой средереагируетс2-тиобарбитуровойкислотой.Образуетсяокрашенныйтриметиновый комплекс с максимумом поглощения при 532 нм. Молярныйкоэффициент экстинкции этого комплекса ‒ 1,56·105см-1·М-1.Кровь, полученную у животных сразу после эвтаназии, ставят сначалана 15 мин в термостат при 37 оС для образования сгустка крови, а затем на15 мин в холодильник, после чего обводят сгусток по внутренней стенкепробирки, центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин (Валеева и др., 2008б).79К 0,3 мл сыворотки (плазмы) приливают 2,4 мл 1/12 N серной кислоты,перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре.

Затемдобавляют 0,3 мл 10%-ного раствора фосфорновольфрамовой кислоты,хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин.Далее центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. Супернатант сливают, а косадку приливают 1 мл дистиллированной воды, перемешивают и вновьцентрифугируют 5 мин при 3000 об/мин. Осадок промывают еще 2 раза притех же условиях. Далее к полученному осадку добавляют 3 млдистиллированной воды и 1 мл 0,8%-ного раствора ТБК.

Перемешивают инагревают в кипящей водяной бане в течение 1 ч. Контрольную пробуготовят в этих же условиях (3 мл воды и 1 мл ТБК). Затем охлаждают ицентрифугируют 20‒30 мин при 6000 об/мин.Оптическую плотность определяют на СФ при 532 нм против контроляна реактивы (Валеева и др., 2008б).Содержание малонового диальдегида в осадке липопротеидов плазмыкровирассчитывают,учитываяразведениеииспользуямолярныйкоэффициент экстинкции (1,56·105см-1·М-1), полученный результат выражаютв мкМ/л:А=Еоп · 106 · 4 мл_________________________51,56 ·10 · 0,3 мл= Еоп · 85,47,где А ‒ содержание МДА в мкмоль/л, 4 мл ‒ объем добавленной воды и ТБК,0,3 мл ‒ объем сыворотки (Валеева и др., 2008б).2.2.5.4. Малоновый диальдегид (ТБК-активные соединения) в тканяхПробы к анализу готовят следующим образом: навеску гомогенатаголовного мозга, сердца, печени, почек, надпочечников, селезенки и тимусапо 50 мг замораживают в фарфоровой ступке жидким азотом, тщательнорастирают.

Полученный тканевой порошок растворяют в 3 мл трис-НСl80буферного раствора (рН 7,4) и добавляют 1 мл 17%-ного раствора ТХУ,центрифугируют при 5000 об/мин 15 мин (Валеева и др., 2008б).Надосадочную жидкость по 2 мл переносят в пробирки, добавляют по1 мл 0,8%-ного водного раствора ТБК. Пробы помещают на 10 мин вкипящую водяную баню. В контрольную пробу вместо надосадочнойжидкости вносят буферный раствор, рН 7,4.После этого пробы охлаждают и измеряют оптическую плотность придлине волны 532 нм против контроля ‒ 2 мл трис-НСl буферного раствора(рН 7,4) и 1 мл 0,8%-ного водного раствора ТБК.Количество малонового диальдегида в ткани органов рассчитывают,используя молярный коэффициент экстинкции, и делят на величину навескив граммах.

Полученный результат выражают в мкМ/г или мкМ/кг.Нормальные величины ‒ показатели интактных или контрольных животных(Валеева и др., 2008б; Гаврилов и др., 1987).812.2.6. ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМАЭксперименты проведены, как описано выше, при оценке показателейПОЛ.

В крови крыс определяли суммарную антиокислительную активность(АОА) сыворотки крови, активности каталазы и пероксидазы в эритроцитахкрови, содержание церулоплазмина (ЦП) в сыворотке крови (Валеева и др.,2008в; Ибрагимова и др., 2012б; 2013).2.2.6.1. Суммарная антиокислительная активность сыворотки кровиПлазма крови в зависимости от состояния ее системы антирадикальнойзащиты способна в той или иной степени подавить инициированноеперекисное окисление липидов (Elahy et al., 2014; Golenia et al., 2014;Jnaneshwari et al., 2013; Yan et al., 2014).).

В условиях инициации перекисногоокислениядвухвалентнымжелезомопределяетсяТБК-активностьвмодельной системе с желточными липопротеидами (ЖЛП) и в той жесистеме с добавлением сыворотки (плазмы) крови.Модельную систему ЖЛП готовили следующим образом: желток яйцаразводили в 50 раз 60 мМ фосфатного буфера, процеживали через 2 слоямарли (можно хранить в холодильнике при температуре 4 оС двое суток).Кровь, взятую из вены после эвтаназии животных, центрифугировали при3000 об/мин 10 мин, отбирали сыворотку (Валеева и др., 2008в).В стеклянные центрифужные пробирки отливали 0,1 мл ЖЛП,прибавляли 0,02 мл плазмы крови и 0,1 мл 25 мМ раствора сернокислогожелеза (приготовленного перед определением), объем доводили до 1 мл 60мМ фосфатным буфером (рН 7,4). Инкубировали 15 мин при 4 оС. Затемдобавляли 1 мл 10%-ной ТХУ, центрифугировали 10 мин при 3000 об/мин.После этого отбирали 1,5 мл надосадочной жидкости в другие стеклянныепробирки и наливали по 1,5 мл 0,8%-ного водного раствора ТБК, ставили вкипящую водяную баню на 10 мин (Валеева и др., 2008в).82После охлаждения измеряли оптическую плотность при длине волны532 нм против дистиллированной воды.

В контрольную пробу добавляли всереактивы в том же порядке, только без плазмы крови.Антиокислительную активность плазмы рассчитывали по следующейформуле в процентах:АОА = 100 ‒Еопыт· 100% ,Еконтрольгде Еопыт ‒ оптическая плотность в системе «ЖЛП‒плазма крови»; Еконтроль ‒оптическая плотность системы ЖЛП без плазмы крови. Нормальныевеличины ‒ показатели интактных или контрольных животных (Валеева идр., 2008в).2.2.6.2. Активность каталазы в эритроцитах кровиПероксид водорода, образующийся в супероксиддисмутазной реакции,а также при функционировании микросомальных и митохондриальных цепейпереноса электронов и других биохимических реакциях, представляетопасность для клеток, так как при разложении пероксида водорода вприсутствии металлов возможно образование активных форм кислорода,которые инициируют перекисное окисление липидов.