Диссертация (Взаимоотношения геномной ДНК и липидов - влияние факторов окружающей среды), страница 12

Де Флора и С. Рэмел, отсутствуетряд групп, в том числе и соединения, антимутагенный эффект которых можетпроявлятьсячерезсистемувторичныхпосредников,аименноаденилатциклазную (Семенов и др., 1994). Это обеспечивается прежде всеголигандами, взаимодействующими с рецепторами, механизм действиякоторых сопряжен с аденилатциклазной системой (Ибрагимова и др., 2005в;2007; 2011а,б; 2014а).Использование имеющихся на рынке фармакологических средств вкачестве антимутагенов и создание новых остается спорным и по сей день.Очевидно,чтотерапевтическомуприназначенииэффектуравнозначныхлекарственныхсредствподействиюипредпочтительнееиспользование тех, механизм действия и отдаленные последствия которых наорганизм хорошо изучены (Гайнуллина, 2000; Ибрагимова и др., 2014а).662.2.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯВданномразделеописаныматериалы,веществаиметоды,использованные при исследовании взаимоотношений ДНК и липидов. Всереактивы и реагенты были химически чистые или чистые для анализа,а дистиллированная вода очищена системой миллиQ.2.2.1. БИОМАРКЕРЫ ЖИРНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА ОБЩИХ ЛИПИДОВГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНОЙ BACILLUS SUBTILIS И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНОЙPSEUDOMONAS AURANTIACA БАКТЕРИЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТЕМПЕРАТУРЫИ ФАЗЫ РОСТАШтамм OSU-142 Bacillus subtilis взят из коллекции микроорганизмовкафедры генетики и биоинженерии Университета Едитепе, г.

Стамбул,Турция (Karlidag et al., 2007). Этот штамм был выращен на питательном агареи хранился в питательном бульоне с 15%-м содержанием глицерина при ‒80 оС.Для каждой серии экспериментов одиночную колонию бактерии помещали в500 мл колбу с питательным агаром и выращивали в колбе на качалке (150оборотов/мин) 48 ч при 28 оС. Стерилизация всех сред проводилась 15 мин вавтоклаве при 121 оС и 1,2 атм (1,02 кг/см2) (HiclaveTM HV-85, Hirayma,Japan). Штамм OSU-142 мог культивироваться на питательном агаре (Fluka),питательной среде (Sigma) или триптическом гидролизате соевого агара(Fluka). В нашей работе логарифмическая (24 ч роста) и стационарная фазы(36 или 48 ч роста) культурыBacillus subtilis, штамм OSU-142, быливыращены на питательном агаре (Fluka) (Ибрагимова и др., 2012а).Анализ жирнокислотного состава (метиловые эфиры жирных кислот,МЭЖК) общих липидов штамма Bacillus subtilis OSU-142 был выполненметодом газовой хроматографии с использованием системы MIDI (SherlockMicrobial Identiftication System version 4.0, MIDI Inc., Newark, DE) всоответствии с описанными в ней протоколами выращивания бактериальныхкультур и спецификацией приборов (Kunitsky et al., 2006).

Хроматограммы с67величинамивременвыходапиковисоответствующихплощадейпродуцировались на интеграторе и переносились в компьютер для анализа,хранения и печати результата анализа. Соотнесение пиков и контрольколонки выполнялись с использованием стандартной калибровочной смесиMicrobial ID 1200-A, содержащей nC9‒nC20-насыщенные и 2- и 3-гидроксижирные кислоты. Состав МЭЖК штамма OSU-142 определялся (длястандартов TSBA6 или 40) с помощью коммерческой базы данных и пакетапрограмм Microbial Identification system software package (MIS version 4.0,Microbial ID, Inc., Newark, DE) (Ибрагимова и др., 2012а; Kunitsky et al., 2006).Каждое определение проводилось по крайней мере 4‒6 раз, причемвариации между значениями были менее 5% для каждой кислоты. Величинысодержания МЭЖК в жирнокислотном составе получены с помощьюметодов статистического анализа (ANOVA one way) и представлены каксредние значения со стандартным отклонением.Штамм B-1558 Pseudomonas aurantiaca («Нахимовская 1948») былполученизколлекциимикроорганизмов(Всероссийскаяколлекциямикроорганизмов, ИБФМ РАН, г.

Пущино, Московская обл.) и предоставленнампроф.Г.И.Эль-Регистан(Институтмикробиологииим.С.Н.Виноградского РАН, Москва) (Веремеенко, Максимова, 2010; Жданов и др.,2012; Peix et al., 2007). Использовался штамм ATCC 33663 = CIP 106718 =NCIMB 10068 = VKM B-876 (www.strainInfo.net).

Этот штамм хранился ибыл выращен согласно протоколу, описанному выше для Bacillus subtilisOSU-142 (Ибрагимова и др., 2012а; Peix et al., 2007).Выделение фракции общих липидовФракции липидов бактерий выделяли согласно следующему протоколу.Осаждали культуру центрифугированием 6000 об/мин в течение 15 мин.Полученный осадок ресуспендировали в 5 мл 0,14 М NaCl. Добавляли 45 млизопропилового спирта.

Суспензию перемешивали на магнитной мешалке в68течение 1 ч при комнатной температуре. Осадок отделяли и процедуруэкстракции повторяли с использованием смеси растворителей хлороформ :метанол (2:1) в количестве 45 мл два раза. По результатам анализа методомтонкослойной хроматографии (ТСХ) получали экстракты и их объединяли.Растворители удаляли в вакууме при температуре не выше 40 оС. Остатокперерастворяли в 45 мл смеси растворителей хлороформ : метанол (2:1) иэкстрагировали в 10 мл воды. Органический слой отделяли. Растворителиудаляли в вакууме. Остаток растворяли в 5 мл хлороформа и наносили наколонку с силикагелем (60 «Merck») объемом 25 мл. Липиды элюировалихлороформом (6 объемов), смесью хлороформ : метанол (9:1) (6 объемов),смесью хлороформ : метанол (7:3) (6 объемов) и метанолом (6 объемов).Элюат собирали в пробирки по 10 мл.

Тонкослойную хроматографиюпроводили на пластинках с силикагелем в системе хлороформ : метанол :вода (65:25:4), хлороформ : метанол : воданый аммиак (65:25:4), хлороформ :метанол : вода : уксусная кислота (80:25:2:5) в качестве проявителяиспользовали спиртовой раствор фосфорномолибденовой кислоты (Валееваи др., 2008а).692.2.2. ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И АНАЛИЗ ЛИПИДОВ,ПРОЧНОСВЯЗАННЫХ С ДНКДля выделения ДНК-липидного комплекса использовали штаммграмотрицательнойбактерииPseudomonas aurantiacaВКМ B-1558(Всероссийская коллекция микроорганизмов, ИБФМ РАН, г.

Пущино,Московская обл.). Природные ДНК-липидные комплексы выделяли спомощью фенольного и детергентного методов. Исследовали природувзаимодействия комплексов липидов и ДНК. Выделяли фракции липидов,связанные с прокариотической ДНК, а именно слабо- и прочносвязанные сДНК липиды, и исследовали жирнокислотный состав прочносвязаннойфракции липидов методом газового хроматографа и масс-спектрометрии.Был разработан биохимический подход ‒ обработка препарата ДНК,выделенногоизPseudomonasaurantiaca,параллельноразличнымиферментами, гидролизующими или ДНК, или РНК, или белки (протеиназа К)(Жданов и др., 2014а).Выделение высокомолекулярной ДНК фенольным методомКультивируют клетки бактерий Pseudomonas aurantiaca для наработкибиомассы до логарифмической стадии роста.

После чего клетки осаждают нацентрифуге при 6000 об/мин в течение 15 мин, полученный осадокресуспендируют в 0,14 М NaCl (рН 7,0) для отмывки от среды. Полученнуюклеточную пасту ресуспендируют, исходя из соотношения 2 г влажнойбиомассы в 100 мл 0,14 М раствора NaCl. К суспензии клеток,предварительно помещенной в круглодонную колбу вместимостью 1 л,добавляют равный объем 66%-ного водного раствора свежеперегнанногофенола (рН 8,5) и дважды экстрагировали. Аккуратными круговымидвижениямиперемешиваютполученнуюсуспензиюиставятнаорбитальную качалку (1 ч, 60‒70 об/мин). Далее смесь центрифугируют втечение 15 мин при 6000 об/мин. В результате в центрифужных пробиркахпроисходит разделение на 3 фазы: верхнюю, содержащую ДНК, среднюю,70состоящую из разрушенных клеток, и нижнюю, фенольную.

После чегоотбирают две верхние фазы и смешивают с новой порцией свежего фенола1:1 помещают на качалку 60 - 70 об/мин на 15 мин. Далее суспензиюцентрифугируют в течение 15 мин при 6000 об/мин, отбирают верхнюю,содержащую ДНК-фазу, смешивают ее в колбе с равным объемом фенола(1:1) Устанавливают колбу на качалку 60‒70 об/мин на 15 мин.Центрифугируют 1 ч со скоростью 6000 об/мин. Отбирают верхнюю фазу идиализируют в течение 3‒4 сут против 0,14 М NaCl для очистки от фенола.Выделенные препараты хранят в темноте при +2 … +4 оС в течение не более10 дней с добавлением капли хлороформа.

При увеличении срока храненияДНК подвергаетсядеструкции, а очень концентрированные препаратыобразуют гели, не пригодные для дальнейшего исследования (Стручков,Стражевская, 1993; Шмырина, 2005; Zhdanov et al., 2006).Выделение высокомолекулярной ДНК детергентным методомОсадок бактерий Pseudomonas aurantiaca из культуральной жидкостиресуспендируют буфером, состоящим из 10%-ного раствора сахарозы с50 ммоль раствора трис-HCl, рН 8,0. После чего добавляют водный растворлизоцима в концентрации 10 мг/мл.

При осторожном перемешиваниисодержимого приливают 0,25 М ЭДТА и ставят на 10 мин в лед. Затемпоочередно приливают 1%-ный раствор SDS и 5 М NaCl, перемешивают ипомещают раствор на 1 ч на лед (конечная концентрация – 1 М). Полученныйраствор разбавляют буфером следующего состава – 3,3% сахарозы, 17 ммольтрис-HCl (pH 8,0), 0,70 ммоль ЭДТА (рН 8,0) и 1,3% SDS. Полученныйвязкийрастворраспределяютпопробиркамипроводятультрацентрицугирование 2,5 ч при комнатной температуре (24 °С, 20 тыс.об/мин) на роторе Beckman (Bruker, США).

На следующем этапе сливают изпробирок супернатант, а оставшийся осадок фракционируют на этом жероторе в градиенте сахарозы. Для этого готовят 10-кратный буферный71раствор следующего состава: 100 ммоль трис-HCl, рН 8,0, 0,15 моль NaCl, 10ммоль ЭДТА, рН 8,0. Далее из этого буфера готовят три раствора: 1) 200 мл20%-ного раствора сахарозы, 2) 200 мл 10%-ного раствора сахарозы и 3) 200мл 5%-ного раствора сахарозы. В 3-м буфере вязкий осадок осторожнораспределяют стеклянной палочкой с утолщением на конце и оставляютсолюбилизироваться на ночь.