Диссертация (Взаимоотношения геномной ДНК и липидов - влияние факторов окружающей среды), страница 13

После чего наслаивают поочередно 1-й, 2-й и3-й растворы в центрифужные пробирки в наклонном состоянии по 20 мл вкаждую. Центрифугируют 10 ч при 24 °С со скоростью 20 тыс. об/мин.Полученный осадок ресуспендируют 0,14 М NaCl и обрабатываютоднократным объемом 66%-ного фенола рН 8,5. На последнем этапеполученный супернатант диализируют против 0,14 М NaCl и определяютсодержание ДНК в образце (Zhdanov et al., 2006, Zimmerman, 2004).Выделение фракций ДНК-связанных липидовФракциюслабосвязанныхлипидов(фракция1)израствороввысокомолекулярной ДНК (вмДНК) бактериальных клеток экстрагируют в35%-ном водном растворе этанола (24 ч при 37 оС) (рис. 1).

После инкубациивмДНК быстро осаждают холодным 96%-ным этанолом (1:2), 3 разапромывают70%-нымэтанолом,полученныеэтанольныеэкстрактысоединяют вместе (фракция 1). Осадок вмДНК (не содержащий липидов)после этанола растворяют в 5 мл 0,14 М NaCl, добавляют 1U ДНКазы в 5 мл0,01 М хлористого магния и инкубируют 2 ч при 37 оС в термостате (фракция2, прочносвязанные липиды) (Шмырина, 2005; Zhdanov et al., 2006).Далее экстракцию слабо- и прочносвязанных липидов (фракция 1 и 2)проводят смесью хлороформ : метанол : вода по методу Бли и Дайера (Bligh,Dyer, 1959), который приспособлен для экстракции липидов из небольшогоколичества ткани, включающей в себя и липиды, и воду (Шмырина, 2005;Zhdanov et al., 2006).72Рис.

1. Схема выделения двух фракций ДНК-связанных липидов фенольнымметодом (по статье Zhdanov et al., 2006) c изменениями.На следующем этапе на каждый 1 мл образца добавляют 3,75 мл смесихлороформ : метанол (1:2) и хорошо перемешивают. Затем добавляют 1,25 млхлороформа и перемешивают. Далее добавляют 1,25 мл дионизированнойводы и повторяют перемешивание. Центрифугируют при 1000 об/мин втечении 5 мин при комнатной температуре, в ходе этой процедурыпроисходит разделение на две фазы: верхнюю, водную и нижнюю,органическую.

Отбирают нижнюю фазу с помощью пастеровской пипетки.Полученные экстракты упаривают и сушат под вакуумом при 40 оС. Осадкифракции 1 и фракции 2 растворяют в 500 мкл хлороформ : метанола (2:1). 50мкл фракции 1 и 100 мкл фракции 2 упаривают, к каждому образцудобавляют дихлорметан (5 мкл) и метилирующий реагент ‒ гидроксидтриметилсульфония (13 мкл в 2,2 M растворе метанола, инкубируют 1 ч)(Стручков, Стражевская, 1990).732.2.3. Липидный и жирнокислотный составы фракций ДНК-связанныхлипидов Pseudomonas aurantiaca по данным масс-спектрометрииДНК из штамма грамотрицательной бактерии Pseudomonas aurantiacaВКМ B-1558 выделяли фенольным методом, как описано в § 2.2.2.Содержание ДНК и РНК определяли спектрофотометрически по методуСпирина, измеряли молекулярную массу ДНК, как описано ранее (Zhdanov etal., 2006).

Выделяли слабо- и прочносвязанные фракции ДНК-связанныхлипидов.Далеепроводилижидкостнуюхроматографиюимасс-спектроскопию пиков фракций ДНК-связанных липидов. Жидкостнуюхроматографию фракций ДНК-связанных липидов Pseudomonas aurantiacaосуществляли на приборе API2000 (Applied Biosystems, США) с AgilentHPLC 1100 c колонкой Reprosil-Pur 120 С18-AQ 100×2,0 mm, 5 µm (TrentecAnalysentechnik, D-70829 Gerlingen) с использованием сэмплера G1329A инасоса G1312A. Масс-спектры пиков фракций ДНК-связанных липидоврегистрировали на приборе модели LC-ESI-MS ‒ масс-спектрометре API2000(Applied Biosystems, США) (turbo spray) в режиме отрицательной (negativemode, -Q1) или положительной ионизации (positive mode, +Q1); 350 °С (Abbet al., 2009; Moder et al., 2007).

Растворители из липидных фракций удаляли иостаток высушивали под вакуумом. Осадки липидов фракций 1 или 2растворяли в 500 мкл смеси хлороформ : метанол (2:1) и наносили 5 мклраствора на колонку модуля прибора высокоэффективной хроматографии(ВЭЖХ, LC) модуля RPС18 с обращенной фазой система ацетонитрил : вода(9 : 1), рН 7, скорость 200 мкл/мин. При оптимизации работы массспектрометра в качестве стандарта использовали наразин (narasin) сформулой С43Н72О11 и молекулярной массой 765,05 г/мол (при режимеположительной ионизации прибор регистрирует пик c m/z 765).742.2.4.

КОМПЬЮТЕРНЫЕ ЭКСПЕРИМЕНТЫ ПО ИССЛЕДОВАНИЮ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯДНК С ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИНАМИКИСтруктура лигандов и комплексов. Структурные параметры линолевой,олеиновой кислот и фосфатидилэтаноламина (ФЭ) с двумя остаткамилинолевой кислоты (нейтральная форма) были получены из базы данныхHIC-Up (Kleywegt, 2007; Minke et al., 1999), а структуры построены спомощьюредакторамолекулAvogadro.Структурыдвухцепочечныхолигонуклеотидов, состоящих из 20 A-T-пар (dA)20·(dT)20 и 25 A-T-пар(dA)25·(dT)25, были сгенерированы с помощью утилиты NAB из пакетапрограмм AmberTools (AMBER 11, University of California, San Francisco,2010). Координаты атомов комплексов даны в соответствии с общепринятойноменклатурой (Lin et al., 2002; McCammon, 2005; Morris et al., 1996; 1998;2001).

Для получения начальных структур комплексов жирная кислота былапомещенавмалуюбороздкуДНК(вихкристаллографическихконфигурациях) с помощью программы VMD. Комплекс был растворен впрямоугольной ячейке периодичности с использованием TIP3P-моделимолекул воды так, чтобы расстояние между периодическими образамикомплекса составляло не менее 15 Ǻ. Для обеспечения электронейтральностисистемы было добавлено необходимое количество ионов натрия. Дляполученной структуры была выполнена минимизация энергии с помощьюметода сопряженных градиентов в программе NAMD (Phillips, 2005). Пригенерировании структуры ДНК использовалась программа AMBER99 (Wanget al., 2004), а для характеризации лигандов ‒ программа GAFF (General AmberForce Field) c зарядами AM1-BCC (Жданов и др., 2014в; Тарасов и др., 2012).Молекулярный докинг.

Для выявления энергетически выгодного положенияфосфатидилэтаноламина в бороздках ДНК и для получения начальныхструктур комплексов был проведен молекулярный докинг ФЭ в ДНК (в ихкристаллографических конфигурациях) с помощью программы AutoDock cприложением vina.exe (Жданов и др., 2014в; Trott, Olson, 2010).75Молекулярнаядинамика.Траекториямолекулярнойдинамикирассчитывалась с помощью программного пакета NAMD. Длины связей былификсированы с помощью алгоритма SHAKE, что позволило использоватьшаг расчета траектории, равный 2 фс.

Все траектории рассчитывались длятемпературы 300 К. Перед расчетом свободной энергии связывания и сборомпараметров система была приведена к равновесию в течение 200 пс.Полученные траектории анализировались с помощью программного пакетаVMD, а также с помощью дополнительных скриптов, написанных на языкеPython. При анализе нековалентных контактов между атомами жирныхкислот и олигонуклеотида рассматривались атомы, расстояние междукоторыми не превышало 3,4 Ǻ (3,4 Ǻ соответствует максимуму ван-дерваальсова притяжения между атомами углерода) (Жданов и др., 2014в;Тарасов и др., 2012).Свободная энергия связывания.

Определение свободной энергии связыванияпроводилось методом адаптивной смещающей силы (Darve et al., 2008),реализованным в программе NAMD (Henin et al., 2010). Этот метод основанна вычислении средней силы Fx вдоль координаты реакции ξ, действиекоторой затем аннулируется равной по величине и противоположной понаправлению смещающей силой, что позволяет системе преодолеватьэнергетические барьеры.

Динамика системы по отношению к координатереакции ξ соответствует случайному блужданию с нулевой среднейдействующей силой. Значения Fx накапливаются на небольших отрезках(диапазонах) ξ, что позволяет оценить значение производной свободнойэнергии dA(ξ)/dξ. В качестве координаты реакции использовалось значениерасстояниямеждуцентрамиатомовлинолевойкислотыивзаимодействующих с ними атомов олигонуклеотида.

Вычисление величинысвободнойэнергиисвязыванияпроизводилосьвходерасчета5-наносекундной траектории молекулярной динамики (Тарасов и др., 2012).762.2.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНДИКАТОРОВ ПЕРЕКИСНОГООКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВЭксперименты проведены на 48 белых рандобредных лабораторныхкрысах обоих полов SPF категории, в каждой группе по 4 самки и 4 самцамассой 230‒250 г. Животныесодержались в условиях вивария согласномеждународным критериям на подстилку rinofix, корм и воду ad libitum.Первая группа – интактные.

Крысам контрольной (второй) группы вводиливнутрибрюшинно однократно стерильную воду для инъекций (ОАО«Новосибхимфарм», г. Новосибирск). Животным опытных групп в том жережиме вводили циклофосфамид (ЦФ, АО «Биохимик» г. Саранск) в дозах20, 40, 60 и 80 мг/кг (Телегин, 2012; Kasamoto et al., 2014; Takahashi et al.,2014). Животных эвтаназировали путем делонгации (Ибрагимова и др., 2014а).В плазме крови определяли содержание гидроперекисей липидов (ГП)и малонового диальдегида (МДА).

В гомогенатах головного мозга, сердца,печени, почек, надпочечников, селезенки и тимуса крыс определялисодержание диеновых конъюгатов (ДК) и МДА (Валеева и др., 2008б,в;Гаврилов и др., 1987; Ибрагимова и др. 2012б; 2013; Jnaneshwari et al., 2013).2.2.5.1. Гидроперекиси липидов в плазме кровиОпределение уровня гидроперекисей липидов заключается в том, чтомолекулы с двумя сопряженными двойными связями в гептане даютмаксимум поглощения в ультрафиолетовой области при длине волны 233 нм.Молярный коэффициент экстинкции составляет 2,2·10 -5 М-1·см-1 (Валеева идр., 2008б).Дляисследованиякровьберутизвеныпослеэвтаназии.Центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. К 0,2 мл плазмы(сыворотки) крови добавляют 4 мл смеси гептана и изопропилового спирта(1:1), пробирки плотно закрывают пробками, встряхивают на лабораторномвстряхивателе (или в ручную) в течение 15 мин. Затем в пробирку вносят771 мл раствора соляной кислоты рН 2,0, встряхивают, добавляют 2 мл гептана,интенсивно встряхивают.