Диссертация (Эффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений), страница 9

После переноса мембрана забивалась в 5% обезжиренном сухом молокев течение 2 часов при температуре 25 0С. С помощью маркера молекулярного весаопределялась линия разреза мембраны таким образом, что в первой частимембраны содержался альфа-тубулин (α-tub), а во второй – исследуемый белок.Фрагменты мембраны инкубировались в соответствующих первичных антителахв течение ночи при +40С. Затем мембраны промывались в PBST (10% tween-20 вPBS) три раза по пять минут и помещались во вторичные антитела,конъюгированныеспероксидазойab97040(«Abcam»,Великобритания).Инкубация со вторичными антителами проводилась в течение 2-х часов прикомнатной температуре. После этого повторялся этап промывки в PBST.Детекция белков проводилась при помощи набора SuperSignal® West Pico RabbitIgG Detection Kit («Thermo Scientific», США) с использованием фотопленки.

Дляанализа результатов использовалась программа ImageJ (версия 1.48). Количествоисследуемого белка было нормировано сравнением с α-tub.532.14 Статистическая обработка данныхСтатистический анализ был проведен с использованием программы KyPlotверсии2.0.множественныхСтатистическийсравненийанализпроводилиТьюки-Крамера.спомощью критерияСтатистическаязначимостьучитывалась при р<0,05. Данные представлены в виде среднего ± ст. ошибкасреднего.543.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Аномалии развития Drosophila с гиперэкспрессей гена APP и собразованием АβИсследованияполноразмерногоAPPпоказалиегозначимостьвразнообразных процессах, в том числе и в развитии нейродегенерации. Например,было показано, что дупликация гена APP приводит к раннему развитию БА саутосомно-доминантным типом наследования и церебральной амилоиднойангиопатии [Rovelet-Lecrux et al., 2005].Трансгенные мыши с гиперэкспрессией APP человека демонстрировалиразнообразныеразвитиякогнитивныенервнойисистемы,нейродегенеративныекрометогоизменения,наблюдалосьдефектыснижениепродолжительности жизни. На клеточных культурах было показано участие APPв дифференциации нейронов и клеточной адгезии.Для более полного понимания функций белка APP мы экспрессировали генAPP человека и его мутантную форму APP-Swedish, приводящую к семейнойформе заболевания, в нервных клетках Drosophila melanogaster.

Кроме того, мыпровели совместную экспрессию этих генов c геном β-cекретазы человека BACE.Так как у Drosophila есть все необходимые компоненты, ответственные заактивность γ-секретазы, совместная экспрессия APP и BACE приводила кобразованию Аβ и последующему его отложению.3.1.1 Выживаемость на стадии куколки трансгенных особей Drosophila cгиперэкспрессией гена APP человека и образованием АβВ предыдущих работах было показано, что гиперэкспрессия APP какотдельно, так и совместно с BACE приводила к существенному падениюпродолжительности жизни имаго [Sarantseva et al., 2009].

В данной работе мыпроанализировали выживаемость куколок трансгенных особей Drosophila. Мыпоказали, что как экспрессия APP, так и образование Аβ приводили к высокойлетальности организмов на стадии куколки. На рис. 8 представлена зависимостьвыживаемости куколок от генотипа.55Рис. 8 Выживаемость куколок в зависимости от генотипа (%)1-elav;+, 2-elav;BACE/APP-SW, 3-elav;BACE/APP, 4-elav;APP-SW, 5-elav;APPКак видно из приведенных выше данных, экспрессия APP приводила кзначительному снижению выживаемости куколок, что указывает на наличиедефектов развития уже на самых ранних этапах жизни Drosophila.

В то же времяэкспрессия APP-SW или APP и APP-SW совместно с BACE приводила к заметномуснижению смертности куколок у трансгенных мух.3.1.2 Морфологические изменения имаго Drosophila c гиперэкспрессиейгена APP человека и образованием АβЭкспрессия APP и APP-Sw в нервных клетках Drosophila как отдельно, так исовместно с BACE вызывала появление большого количества морфологическиханомалий у взрослых мух, которые проявлялись в виде меланизации и некрозатканей в области хоботка, патологических изменениях самого хоботка,56недоразвитых крыльев и раздутых абдоменов, заполненных гемолимфой, чтоговорит об активном воспалительном процессе. Пример морфологическиханомалий, наблюдаемых при экспрессии APP представлен на рис.

4.Рис. 9. Морфологические аномалии в мухах с гиперэкспрессией APP.A) Гиперэкспрессия APP вызывает сильную деформацию и некроз хоботка,неразвитые крылья и раздутый абдомен; Б) Мухи генотипа elav;+;+ необнаруживают морфологических аномалий. 1-крылья, 2-абдомен, 3-хоботокТакие мухи были нежизнеспособны и погибали в течение первых дней послевылупления. Повышенная летальность, по-видимому, была вызвана изменениямиротового аппарата (рис. 11), что приводило к невозможности потребления мухамипищи.Интересно, что наблюдаемые морфозы могли проявляться как совместно, таки отдельно друг от друга.

Изменения же ротового аппарата в большинствеслучаев сопровождались меланиезацией тканей.Вне зависимости от исследуемого генотипа наиболее часто встречалисьдефекты развития ротового аппарата и меланиезация хоботка, реже –недоразвитые крылья и раздутый абдомен.57Рис. 10. Распределение типов морфозов по отношению к общему количествуморфозов.A) Мухи генотипа elav; APP; Б) Мухи генотипа elav; BACE/APP; В) Мухигенотипа elav; APP-Swedish; Г) Мухи генотипа elav; BACE;APP-Swedish.

1деформация хоботка; 2-некроз тканей; 3-недоразвитые крылья; 4-раздутыеабдомены.58Рис. 11. Деформация хоботка в мухах с гиперэкспрессией APP.A) Мухи генотипа elav;+;+ не обнаруживают морфологических измененийхоботка; B) Гиперэкспрессия APP вызывает сильную деформацию хоботка. 1основание хоботка; 2-верхняя губа; 3-нижнечелюстные щупики; 4-нижняя губа; 5лабеллумы с псевдотрахеями.У мух с аномальной морфологией наблюдалось появление асимметрии встроении основания хоботка и его увеличение на 20-30% по сравнению сконтролем. Кроме того, в отличие от контрольной линии, у исследуемых мухнаблюдалось также 20-30% утолщение верхней и нижней губ.

Нижнечелюстныещупики также были заметно увеличены. При приблизительно одинаковой длинеих ширина была на 30-50% больше, чем у контрольной линии. Лабеллумы спсевдотрахеями были явно деформированы, что, по всей видимости, и приводилок невозможности потребления пищи.593.1.3 Распределение морфологических аномалий имаго Drosophila взависимости от генотипа исследуемых мухМы исследовали частоту встречаемости аномальных морфологическихизменений или морфозов у взрослых мух различных генотипов, выращенных какна стандартной дрожжевой среде, так и на более питательной среде, содержащеймелассу. Среда с мелассой была использована в эксперименте для оценки влияниякалорийностиначастотувозникновенияаномальныхморфологическихизменений. Результаты эксперимента представлены на рис.

12.Рис. 12. Частота встречаемости морфозов (%)1-elav;APP, 2-elav;APP + меласса, 3-elav;APP-SW, 4-elav;APP-SW + меласса,5-elav;BACE/APP, 6-elav;BACE/APP + меласса, 7-elav;BACE/APP-SW, 8elav;BACE/APP-SW + меласса.Как видно из приведенных выше графиков, частота появления морфозовзависела от генотипа исследуемых мух. Наиболее часто морфозы встречались влинии с гиперэкспрессией APP. Мы наблюдали снижение их количества как у мухс гиперэкспрессией APP-Sw, так и с гипреэкспрессией APP и BACE. А для линии с60одновременной гиперэкспрессией APP-Sw и BACE они были минимальны.Повышение питательности среды не оказало влияния на частоту возникновенияморфологических аномалий.Мы полагаем, что уменьшение количества морфозов при одновременнойэкспрессии APP и BACE объясняется падением уровня белка APP в нервныхклетках Drosophila.

Падение же количества морфозов при экспрессии гена APP смутацией Swedish, возможно, объясняется ускорением процессинга APP.Необходимоотметить,чтоэкспрессиятолькопоследовательности,кодирующей Аβ42 в мозге трансгенных особей Drosophila не приводила кописанным выше дефектам развития.

Изучение трансгенных линий мух, несущихген другого крупного трансмембранного белка человека PSEN-1 или ген BACEтакже не выявило морфологических отклонений в развитии Drosophila.Полученные нами результаты показывают, что именно экспрессия APP в мозгеDrosophila приводит к наблюдаемым патологическим дефектам развития.Chakrabortyetal.,исследуятежетрансгенныелинии,связалморфологические аномалии развития Drosophila с отложением Аβ и образованиемамилоидных агрегатов. Было предположено, что подобные аномалии вызываютсяактивацией воспалительного ответа в ответ на образование и олигомеризацию Аβ,что противоречит полученным нами данным. В нашем исследовании мыпоказали, что частота морфозов значительно падает именно в линиях, в которыхпроисходит образование Аβ.