Диссертация (Эффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений), страница 10

Высокая смертность куколок и мух с экспрессиейполноразмерного APP подтверждает, что именно экспрессия этих генов, а необразование Аβ ответственна за наблюдаемые дефекты развития.Подобные дефекты и в самом деле могут быть вызваны работой иммуннойсистемы Drosophila. Однако мы полагаем, что за активацию иммунного ответа вданном случае ответственен именно полноразмерный APP.Анализируя полученные данные, мы предположили, что наблюдаемые приэкспрессии APP морфологические изменения вызываются активацией иммунногоответа через TLR (Toll-like receptors) рецепторы.

Green at. аl. наблюдали схожие61аномалии развития Drosophila, а именно меланизацию, некротические измененияхоботка и увеличение абдоменов при активации сигнального пути TLR.TLR – часть сигнального каскада врожденного иммунитета. Основнаяфункция TLR – распознавание консервативных структур микроорганизма иактивация иммунного ответа.

Конечным этапом сигнального пути TLR уDrosophila является активация двух представителей семейства факторовтранскрипции NF-κB – белков Dif и Dorsal. Интересным фактом является то, что,согласно Grilli et al., в 5’-регуляторной области гена APP содержатся двеидентичныепоследовательности,являющиесяспецифичнымисайтамисвязывания белков активаторов транскрипции NF-κB. Они также показали, чтоактивность этих сайтов коррелирует с уровнем экспрессии гена APP.Более того, было показано усиление экспрессии гена APP при активномвоспалительном процессе (например, в мозге пациентов с травмой мозга)[Murakami et al., 1998].

Подобные же результаты были получены и вэкспериментах на крысах [Itoh et al., 2009].Кроме того гиперэкспрессия APP может приводить к дестабилизации геномаи нарушению репарационных процессов. Stante et. al. показали, что APPнеобходим для активации и переноса в ядро белка FE65, который обнаруживаетсяповсеместно в геноме и принимает участие в конденсации хроматина. Кроме того,FE65 играет центральную роль в рекрутировании ацетилтрансферазы TIP60,принимающей участие в ацетилировании гистона H4 при репарации поврежденийДНК. В ряде работ показано увеличение транскрипции APP при развитииразличных форм рака. Дестабилизация генома в свою очередь может приводить кдефектам развития Drosophila, что и обуславливает появление аномальныхморфологических изменений.Другим возможным механизмом является участие белка Notch в развитииDrosophila.

Наблюдаемые нами патоморфологические изменения могут бытьследствием конкуренции между полноразмерным АРР и белком Notch при ихвзаимодействии с функциональными партнёрами. Notch принимает участие в62клеточной дифференциации и пролиферации путем регуляции генной экспрессии[Wolfe M.S., 2002].

Непосредственно в регуляции экспрессии участвует короткийпептид NICD, отщепляющийся от Notch в результате процессинга белка двумяпротеазами, одной из которых является γ-секретаза [Hartmann et al., 2001]. В то жевремя, γ-секретаза участвует в процессинге APP. Гиперэкспрессия APP втрансгенных мухах приводит к возникновению конкуренции между APP и Notchза γ-секретазу, что в конечном итоге и приводит к аномальному развитиютрансгенных мух.

Также APP может выступать в роли лиганда Notch, тем самымактивируя сигнальный путь Notch, что приводит к чрезмерному образованиюNICD, что, в свою очередь, также может вызывать отклонения в развитии мух [Ohet al., 2005].Подтверждениемэтойгипотезыможетслужитьраспределениеморфологических аномалий в зависимости от пола, представленный на рис.

13.Рис. 13 Распределение аномалий в зависимости от пола (%)1-elav;APP, 2-elav;APPSW, 3-elav;BACE/APP, 4-elav;BACE/APPSW63Ген белка Notch в Drosophila расположен на X хромосоме. Таким образом, усамок содержится две копии гена, в то время как у самцов – только одна.Несмотря на наличие у самцов Drosophila механизма компенсации дозы гена, врезультате которого гены, кодируемые на X хромосоме, экспрессируютсяинтенсивнее, у самок и самцов возможны различия в уровне белка Notch.Повышенный уровень Notch у самок может объяснить зависимое от полараспределение морфозов при гиперэкспрессии APP.Таким образом, приведенные выше данные показывают, что нарушениефункционирования и процессинга белка APP, наряду с типичными для БАнейродегенеративнымипроцессами,можетприводитькактивациивоспалительного ответа через TLR-рецепторы.

Кроме того мы предполагаем, чтоподобные нарушения могут вести к дестабилизации хроматина и нарушениюпроцесса репарации, а также нарушению в процессах дифференциации ипролиферации.3.2 Транскрипционные изменения генов синаптических белков в мозгевзрослых мух при гиперэкспрессии APP и образовании АβРезультаты многочисленных исследований показывают, что самым раннимпроявлением БА является прогрессирующее падение синаптической плотности,сопровождаемоезначительнымснижениемсодержанияосновныхпресинаптических белков в мозге больных БА [Davidsson et al., 1998; Masliah andTerry, 1993]. Степень подобного падения коррелирует с тяжестью деменции исостоянием пациента. В то же время изменение уровня белков, принимающихнепосредственное участие в синаптической передаче и формировании синапсовможет идти разнонаправленно, либо вообще не меняться.

Так, Sze et al. показали,что уровни белков синапсин-1 и SNAP не менялись ни у пациентов с выраженнойкогнитивной дисфункцией, ни у пациентов с начальной стадией когнитивныхизменений. В то же время уровень синаптотагмина значительно падал в областях,ответственных за формирование и консолидацию памяти - гиппокампе и64энторинальной области коры головного мозга, а падение уровня синаптобревинанаблюдалось независимо от исследуемого отдела [Sze et al., 2000].Подобные же результаты были получены также и на трансгенных мышах, сгиперэкспрессией АРР человека, воспроизводящих основные признаки БА[Chapman et al., 1999; Mucke et al., 2000]. Например, исследования синаптическойплотностивмозгемышейсгиперэкспрессиейAPP-Swedishпоказалисущественное уменьшение уровня syt в коре и гиппокампе трансгенных мышей[Wang et al, 2012].

Попытки объяснить этот эффект не дали однозначногорезультата. Анализ транскриптов на чипах Affymetrix HuFL, проведенный нааутоптатах мозга больных спорадической формой БА (средний возраст 82.7),показалснижениеуровнятранскриптовмРНКдляосновныхклассовсинаптических белков [Yao et al., 2003]. В то же время эксперименты натрансгенных мышах (возраст 22 месяца) показали спектр изменений содержаниясинаптических белков, отличный от наблюдаемого у больных [Yao et al., 2003].Также было показано значительное снижение уровня экспрессии гена syt [Mufsonet al., 2002] и генов VAMP1 и VAMP2, кодирующих две изоформы белкасинаптобревина человека в мозге больных БА [Bossers et al., 2009].

Следуетзаметить, что в этих экспериментах отсутствовали результаты для ранних стадийБА. Возможно именно это обстоятельство не позволило отличить первичныйэффект нарушения синаптогенеза от других эффектов нейропатологическогопроцесса.Drosophila содержит гомологи синаптических белков человека. Например, уDrosophila было выделено 7 различных изоформ белка syt, из которых только syt1обнаруживается в большом количестве в синапсах.Также было выделено 2изоформы белка syb. Первый, получивший название synaptobrevin, образуется ворганизме повсеместно. Мутации в гене этого белка приводят к летальности ужена стадии эмбрионального развития. Исходя из функций синаптобревинов умлекопитающих, можно предположить, что syb способствует перемещениюбелков к поверхности клеток, при нарушениях которого клетки не в состояниирасти и делиться.

Второй изоформой cинаптобревина является так называемый65нейрональныйсинаптобревин(n-syb)ионобнаруживаетсявбольшихколичествах исключительно в синапсах.Ранее Sarantseva et al. показали существенное падение уровня белков syt1 и nsyb при гиперэкспресии APP, АРР-Sw и при совместной их экспрессии с BACE вантеннальных долях и в грибовидном теле мозга Drosophila – структурах,отвечающих за формирование памяти и поведения, начиная с первых дней жизниживотных.