Диссертация (Эффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений), страница 7

Поэтому для изучения БАиспользуются также нематоды. Например, экспрессия гена дикого и мутантноготипа тау приводила к поведенческим и синаптическим нарушениям в нематодах[Kraemer et al., 2003]. Благодаря исследования на нематодах было подтвержденоучастие белков aph-1 и pen-2 в формировании гамма-секретазного комплекса.Кроме того, на нематодах проводятся исследования по изучению мутаций PSEN-1[Francis et al., 2002].Распространенным модельным организмом является Drosophila melanogaster.В последнее время генетически хорошо изученные плодовые мушки сталииспользоваться как экспериментальная модель для изучения механизмов,лежащих в основе развития нейродегенеративных заболеваний человека, вчастности, БА [Greeve et al., 2004; Finelli et al., 2004; Bilen and Bonini. 2005].Большим преимуществом Drosophila является возможность направленнойэкспрессии генов в Drosophila благодаря системе GAL4/UAS [Brand and Perrimon,1993].

Использование моделей БА на Drosophila позволяет одновременноизмерить самые ранние изменения уровня синаптических белков и показателикогнитивных функций.39ЭкспрессиядикогоимутантногоtauвDrosophilaприводилакпрогрессирующей нейродегенерации и преждевременной гибель мух и ускорялаотложение белка в холинэргических нейронах.

В то же время, как и в мышах,образование нейрофибриллярных клубков не происходило [Wittmann et al., 2001].В Drosophila был обнаружен активный γ-секретазный комплекс, активностьже β-секретазы либо полностью отсутствует, либо сведена к минимуму [Fossgreenet al., 1998]. Было показано, что дрозофильный гомолог β-секретазы человекаможет участвовать в процессинге APP человека, но расщепление происходит посайту, отличному от сайта действия человеческой β-секретазы, в результате чегоне происходит образование Aβ [Greeve et al., 2004; Carmine-Simmen et al., 2009].

УDrosophila также есть гомолог APP человека – белок APPL, который не содержитпоследовательности Aβ. Было показано, что экспрессия человеческого APP вDrosophila совместно с геном β-секретазы (BACE) человека приводит котложению Aβ и сопутствующей этому патологии.Экспрессия APP в Drosophila вызывала целый спектр нарушений, начиная отчастичной смерти клеток мозга на стадии личинки [Fossgreen et al., 1998], донейродегенерации в мозге имаго, ухудшению памяти и способности к обучению,нарушению клеточной адгезии и сигнальных механизмов [Sarantseva et al., 2009].Прямая экспрессия в Drosophila последовательностей, кодирующих Aβ40 иAβ42 приводила к появлению сильных, но различных фенотипов.

ОбразованиеAβ42 приводило к отложению Аβ, изменению когнитивных функций инейродегенерации, в то время как при образование Aβ40 при схожих когнитивныхизменениях не обнаруживалась ни дегенерация нейронов, ни формированиеагрегатов. Любопытно, что средняя продолжительность жизни мух с Aβ42,составляла 24 дня. В то же время мухи с Aβ40 жили более 30 дней, что, возможно,указывает на слабую токсичность или полное отсутствие токсичности даннойформы Аβ [Iijima et al., 2004].40Приведенные выше литературные данные показывают, что в настоящеевремя не существует единой теории, объясняющей весь патогенез БА.

Выработкаподобнойтеорииневозможнабезпониманияроливсехучастниковнейродегенеративных процессов. На сегодняшний день изучение таких белковкак APP, PSEN-1, APOE и др. и анализ их функций – одно из приоритетныхнаправлений в исследовании БА. Для этих целей широко используютсяразнообразныетрансгенныелинииDrosophila.Относительнаяпростотаманипуляции с геномом Drosophila, короткий жизненный цикл, небольшиеразмеры и стоимость содержания позволяет в кратчайшие сроки оценить влияниеинтересующихобъектовисследованиянабиохимическиепроцессы,происходящие в организме.

В данной работе, используя Drosophila, мыпроанализировали функции основного «источника» Аβ – белка APP, что крайневажно для разработки новых лекарственных препаратов, так как именноантиамилоидогеннаятерапиянасегодняшнийденьсчитаетсянаиболееперспективным способом лечения БА. Кроме того хорошо развитая центральнаянервная система и наличие гематоэнцефалического барьера, являющегосяструктурным и функциональным гомологом гематоэнцефалического барьерамлекопитающих, делают Drosophila крайне удобным инструментом для быстрогоанализа разнообразных веществ на их потенциальное позитивное влияние нанейродегенеративные процессы, наблюдаемые при БА.

Подобный быстрыйскрининг крайне важен для поиска новых эффективных препаратов для лечениязаболевания.2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ2.1 Линии мух, использованные в работе, и условия их содержанияБыли использованы следующие линии Drosophila melanogaster с экспрессиейчеловеческого APP и его форм:UAS-APP (далее в тексте APP) - содержит ген АРР человека;41UAS-APP-Swedish (далее в тексте APP-Swedish) - содержит ген АРР человекас мутацией Swedish;UAS-APPNT (далее в тексте APPNT) - содержит укороченную форму генаAPP695, в которой последовательность сигнального пептида соединена напрямуюспоследовательностью,кодирующейAβ,трансмембраннымдоменомицитоплазматическом хвостом;UAS-APPСT (далее в тексте APPСT) - содержит укороченную форму генаAPP695, в которой удалена большая часть цитоплазматического конца, заисключение короткого мембранного якоря (KKKR-stop).Схематично это линии представлены на рис.

4Рис. 4. APP и его формы, использованные в работе. Стрелками показанысайты расщепления соответствующих секретаз, СП – сигнальный пептид, ЦХ –цитоплазматический хвост, хх - мутация Swedish, myc - myc-tagТакже в работе были использованы следующие линии:UAS-APP.Abeta42 (далее в тексте Abeta) - содержит последовательность,кодирующую Aβ42;42UAS-BACE (далее в тексте BACE) - содержит ген бета-секретазы человека;UAS-PSEN1 (далее в тексте PSEN1) - содержит ген пресенилина 1 человека;UAS-PSEN1.M146V (далее в текстеPSEN1-M146V) -содержит генпресенилина 1 человека с мутацией, приводящей к одноаминокислотномузамещению M146V;UAS-PSEN1.P267S (далее в тексте PSEN1-P267S) - содержит ген пресенилина1 человека с мутацией, приводящей к одноаминокислотному замещению P267S;UAS-GFP – содержит последовательность, кодирующую белок GFP (greenfluorescence protein – далее в тексте GFP).Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе, были получены изколлекции Drosophila Bloomington Stock Center.Экспрессия данных генов была проведена в системе GAL4-UAS при помощиактиватора транскрипции elav-Gal4, запускающего транскрипцию в нервныхклетках.Мухи содержались на стандартной дрожжевой среде при температуре 25 оСпри 12 часовом световом дне.В опыте по оценке морфологических аномалий в трансгенных мухах такжеиспользовалась среда обогащенная мелассой.

Для этого к стандартной дрожжевойсреде добавлялось 10% мелассы.В опыте с белым и красным пигментом дрожжей до достижения возраста в25 дней мухи содержались на агаре с дрожжами, как образующими, так и необразующими красный пигмент.2.2 Анализ выживаемости куколок трансгенных особей DrosophilamelanogasterДля оценки выживаемости куколок необходимые для скрещивания мухипомещались в емкости со стандартной дрожжевой средой на срок до 1 дня, послечего удалялись.

На 12 день после удаления родителей фиксировалось количество43вылупившихся мух. После чего определялось процентное отношение числавылупившихся мух к общему количеству образовавшихся куколок.2.3Приготовлениеобразцовдлямикроскопииморфологическихизменений внешних органов и ротового аппарата трансгенных особейDrosophila melanogaster на стадии имагоАнализ морфологических изменений ротового аппарата трансгенных особейDrosophila melanogaster на стадии имаго проводили у 1-дневных мух.

Послеобработки эфиром животных с удаленными крыльями на 30 минут помещали в10% KOH, нагретый до 95°C, после чего промывали водой и инкубировали всмеси глицерина и 1M Tris-HCl pH 7.5 (соотношение 9:1) в течение 12 часов.Затем головы отделяли от тела и фотографировали.Для исследования изменений морфологии крыльев, абдомена и головыиспользовали стереомикроскоп.2.4 Оценка количества морфологических аномалий в трансгенныхособях Drosophila melanogasterЧастота появления морфологических аномалий определенного типа втрансгенных мухах высчитывалась следующим образом: для каждого опытаопределялось число мух с морфологическими аномалиями определенного типа,после чего вычислялось процентное отношение получившегося значения кобщему количеству аномалий.Дляоценкираспределениячастотыморфологическиханомалийпогенотипам, определяли общее число мух с любым количеством и типом аномалийотносительно общего числа вылупившихся мух.Среднее число морфологических аномалий на муху с дефектами развитияопределялось следующим образом: в каждом опыте для каждой мухивысчитывалось количество морфологических аномалий, проявившихся в данноймухе, после чего получившиеся значения суммировались и итоговое значениеделилось на общее число мух с любым дефектом развития.44Для оценки распределения морфологических аномалий относительно полаопределялось процентное отношение как самцов, так и самок с дефектамиразвития к общему количеству имаго с морфологическими аномалиями.2.5 Выделение РНКДля выделение РНК использовали 40 голов мух нужного генотипа.Выделение проводили с помощью набора фирмы-производителя «Zymo ResearchZR Tissue & Insect RNA MicroPrep™» согласно протоколу.

В процессе выделения,согласно дополнительному протоколу, образцы обрабатывали ферментомДНКазой (ООО "БиолоТ") для предотвращения контаминации РНК.Целостность фракций РНК проверяли при помощи электрофореза в 1%агарозном геле.2.6 Обратная транскрипцияВсе манипуляции с РНК и реактивами для реакции обратной транскрипциипроводились на льду. В стерильную пробирку были добавлены следующиекомпоненты: 1мкг выделенной РНК, 0.5мкг праймеров Fermentas Oligo(dT) 18Primer (100пМ), 6 мкл воды двойной дистилляции. Полученную смесьикубировали 5 минут при температуре 70оС после чего пробирку помещали налёд.

Затем к смеси добавили Fermentas RiboLock RNase Inhibitor (конечнаяконцентрация - 20ЕА), 4мкл буфера Fermentas 5Х Reaction Buffer for RT(конечные концентрации компонентов: 4мМ MgCl2, 50мМ Tris-HCl [pH8.3 при25оС], 50мМ KCl, 10мМ DTT) и смесь 10mM dNTP Mix (Fermentas) (конечнаяконцентрация каждого нуклеотида - 1мМ). Полученную смесь инкубировали 5минут при 37оС, после чего добавили обратную транскриптазу FermentasRevertAid M-MuLV RT (40ЕА) и продолжили инкубировать при 37оС в течениечаса. По истечении часа смесь инкубировали 10 минут при 70оС для остановкипроцесса.2.7 Проведение ПЦР в реальном времениДляопределениеуровнятранскрипциимРНКисследуемыхгеновиспользовался метод Taqman® real-time PCR - количественной ПЦР в режиме45реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan.

Используемые в методепраймеры и пробы были разработаны в программе PrimerExpress. Длянормирования результатов в качестве референс-генов были использованы геныRP-49 (рибосомальный протеин L32) и GAPDH2 (глицеральдегид 3 фосфатдегидрогеназа 2) Drosophila. В качестве флуоресцентной метки зондов для кДНКгенов RP-49 и GAPDH2 использовался краситель R6G, зондов для кДНК геновsyt1, n-syb, psn и – FAM.