Диссертация (Эффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида в нервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений)

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР "КУРЧАТОВСКИЙИНСТИТУТ" ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ ИМ. Б.П.КОНСТАНТИНОВАНа правах рукописиРОДИН Дмитрий ИгоревичЭффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида внервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений03.02.07 – генетикаДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наукСаранцева С.В.Cанкт-Петербург20142Список сокращений………………………………………………………........5Введение…………………………………………………………………………61. Обзор литературы…………………………………………………………..121.1 Нейродегенеративные заболевания…………………………………..121.2 Болезнь Альцгеймера (БА): клиническая и патоморфологическаясимптоматика, диагностика и лечение…………………………………...121.2.1 Патоморфологические и патогистологические признакиБА…………………………………………………………………………...141.2.2 Семейные и спорадические формы БА………………….................181.2.3 Участники патологических процессов при БА…………................221.3 Эпигенетика и БА……………………………………………………...251.3.1.

Эпигенетическая модификация гистонов при БА……………261.3.2 Метилирование ДНК при БА…………………………………..261.3.3 Роль микроРНК в БА……………………………………….......271.4ЛечениеБА:существующиелекарственныепрепаратыипрепараты, находящиеся в разработке…………………………………...281.5 Моделирование основных признаков БА на животных…………….362. Материалы и методы………………………………………………….......402.1 Линии мух, использованные в работе, и условия их содержания…402.2 Анализ выживаемости трансгенных особей Drosophila melanogasterна стадии куколки………………………………………………………….422.3 Приготовление образцов для микроскопии морфологическихизменений внешних органов и ротового аппарата трансгенных особейDrosophila melanogaster на стадии имаго………………………………..432.4 Оценка количества морфологических аномалий в трансгенныхособях Drosophila melanogaster…………………………………………..432.5 Выделение РНК………………………………………………………..442.6 Обратная транскрипция…………………………………………….....4432.7 Проведение ПЦР в реальном времени…………………………….....442.8 Определение статуса метилирования промоторной области геновsyt1 и n-syb…………………………………………………………………472.9 Анализ выживаемости трансгенных особей Drosophila melanogasterна стадии имаго…………………………………………............................482.10 Определение и анализ уровня нейродегенерации в мозге взрослыхтрансгенных особей Drosophila melanogaster…………………………….

482.11 Подготовка образцов и проведение конфокальной микроскопиидля детекции амилоида в мозге имаго Drosophila melanogaster…….....492.12 Оценка изменения локомоторной активности, способности кобучению и формированию памяти трансгенных особей Drosophilamelanogaster на стадии имаго………………………………………….....592.13 Измерение уровня белков в мозге трансгенных особей Drosophilamelanogaster………………………………………………….....................512.14 Статистическая обработка данных……………………………….....533. Результаты и обсуждение………………………………………………....543.1 Аномалии развития Drosophila с гиперэкспрессей гена APP и собразованием Аβ…………………………………………………………..543.1.1 Выживаемость на стадии куколки трансгенных особейDrosophila c гиперэкспрессией гена APP человека и образованиемАβ……………………………………………………………………..3.1.2МорфологическиеизмененияимагоDrosophila54cгиперэкспрессией гена APP человека и образованием Аβ……......553.1.3 Распределение морфологических аномалий имаго Drosophilaв зависимости от генотипа исследуемых мух………………………593.2 Транскрипционные изменения генов синаптических белков в мозгевзрослых мух при гиперэкспрессии APP и образовании Аβ ..................633.2.1 Изменение уровня мРНК генов syt1 и n-syb в мозге взрослыхтрансгенных особей Drosophila ……………..……………………..3.3 Метилирование ДНК как один из факторов, регулирующих654активность генов синаптических белков в трансгенных особяхDrosophila………………………………………………………………......723.4 Изучение влияния содержания взрослых особей Drosophilamelanogaster c экспрессией последовательности, кодирующей пептидАβ42, на среде с дрожжами-продуцентами красного пигмента наамилоидогенезинейродегенеративныепроцессывмозгемух………………………………………………………………………….743.4.1 Изучение влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на амилоидогенезв мозге взрослых мух…………………………………………………763.4.2 Изучение влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгеннымиособямиDrosophilamelanogasterнанейродегенерацию в мозге взрослых мух………………………......803.4.3 Анализ влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на выживаемостьвзрослых мух……………………………………..................................

823.4.4 Анализ влияния потребления красного штамма дрожжей налокомоторные функции, способность к обучению и памятьтрансгенных особей Drosophila melanogaster ……………………… 83Выводы………………………………………………………………………......85Список литературы………………………………………………………......86Благодарности…………………………………………………………............... 1045СПИСОК СОКРАЩЕНИЙБА – болезнь АльцгеймераAPP – белок предшественник амилоидаPSEN – пресенилин человекаpsn – дрозофильный гомолог PSEN человекаАβ – амилоидный пептид βНЗ – нейродегенеративные заболеванияNMDA – N-метил-D-аспартатAMPA – альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислотаАРОЕ – аполипопротеин ЕBACE – бета-секретазаGWAS – полногеномный поиск ассоциацийSMSSE – Standardized Mini-Mental State Examination – тест, направленный навыявление когнитивных расстройствADAS (Alzheimer Disease Assessment Scale – усовершенствованный аналогSMMSE)GFP – зеленый флуоресцентный белокRP-49 – рибосомальный протеин L32GAPDH2 – глицеральдегид 3 фосфат дегидрогеназа 2syt1 – синаптотагмин-1n-syb – нейрональный синаптобревинtau – ассоциированный с микротрубочками белок тау6ВведениеАктуальностьпроблемы.Белок-предшественникамилоида(APP)–крупный трансмембранный белок, в большом количестве обнаруживаемый всинапсах нейронов.

Этот белок принимает участие в развитии различныхзаболеваний, среди которых можно выделить синдром Дауна, амилоиднуюангиопатию и болезнь Альцгеймера. На сегодняшний день функции АРР неясны.Однако было показано, что он участвует в разнообразных процессах,включающих клеточную адгезию, клеточную сигнализацию, формированиеструктуры и функций нейронов [Breen et al., 1991; Neve et al., 2007; Stante et al.,2009].Основным механизмом протеолиза APP является его расщепление тремяпротеазами, получившими название α-, β- и γ-секретаз. Процессинг APPосуществляется по так называемому амилоидогенному (при участии β- и γсекретазы) и неамилоидогенному пути (соответственно, при участии α- и γсекретазы).

Основным отличием амилоидогенного пути от неамилоидогенногоявляется образование в результате расщепления APP небольшого по размерамамилоидного пептида–бета (Аβ). В свою очередь, нарушение метаболизма Аβприводит к его агрегированию и образованию так называемых сенильных бляшек-одногоизглавныхмаркеровширокораспространённогостарческогонейродегенеративного заболевания - болезни Альцгеймера (БА).БА - одна из значимых медицинских проблем современного мира. Развитиеклассической альцгеймеровской симптоматики обычно начинается после 65 лет.После этого возраста риск заболевания удваивается каждые пять лет и уже к 80годам частота заболевания доходит до 25%.

Кроме того, существует и ранняяформа заболевания, поражающая людей в возрасте от 30 до 50 лет. По оценкамВсемирной организации здравоохранения, в мире около 30 миллионов человекстрадает этим заболеванием.БА характеризуется тяжелой и разнообразной симптоматикой, включающейамнезию, зрительно-пространственные и временные нарушения, алексию,7аграфию. Дальнейшее прогрессирование заболевания ведет к полной афазии,оральным и хватательным автоматизмам, насильственному смеху и плачу,общему физическому истощению и, в конечном итоге, к летальному исходу.На сегодняшний день не существует эффективного способа лечения БА. Загоды исследований заболевания было протестировано и отвергнуто множествопрепаратов. В большей степени это связано с отсутствием глубинного пониманиямеханизмов, ведущих к развитию патологии. Тем не менее, с каждым годом числотестируемых препаратов растет.

Наиболее перспективными являются соединения,обладающие антиамилоидогенной активностью, т.е. способные восстанавливатьгомеостаз Аβ.Диагностирование заболевания на сегодняшний момент осложнено в связи сотсутствием прижизненных маркеров и точная постановка диагноза возможналишь в результате посмертной аутопсии мозга. Аутоптат мозга пациентов обычновыявляет наличие классических маркеров БА – деградацию тканей мозга иналичие амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков.Согласно гипотезе амилоидного каскада токсичные растворимые формы Аβзапускают множество разнообразных процессов, включающих нарушениеэнергообмена, разрушение структуры цитоскелета и воспаление, что в итогеприводят к дисфункции нейронов, нарушению синаптической передачи икогнитивным изменениям.

Несмотря на наличие множества данных, бесспорноподтверждающих правомерность амилоидной гипотезы, более пристальноеизучение вопроса последних лет показало, что не только вызываемый Аβ каскадпатологических изменений, но и ряд других не связанных или опосредованносвязанных с Аβ параллельных процессов может вести к манифестацииклинической симптоматики заболевания. Среди этих процессов можно выделитьпатологические изменения цитоскелета нейрона, нарушение антиоксидантнойсистемы, нарушение апоптоза, изменение клеточного метаболизма и др.

[Brion,1998; Peers et al., 2007; Kumar-Singh, 2008; Kroner, 2009; Su et al., 2008, BermejoPareja et al., 2010].8БА с ранним началом в основном имеет семейный анамнез и обуславливаетсямутациями в генах, кодирующих APP, PSEN-1 (пресенилин-1) и PSEN-2(пресенилин-2). В то же время причины спорадических случаев заболевания досих пор неясны. Современные методы молекулярно-генетических исследований,например,полногеномныйпоискассоциаций,продемонстрировалимногофакторность БА.

Был выделен ряд генов, мутации в которых ассоциированыс заболеванием, однако роль кодируемых ими белков в нейродегенеративномпроцессе неочевидна. [Dreses-Werringloer et al., 2008; Kan et al., 2005; Liu et al.,2013].Кроме того не до конца ясна функция полноразмерного белка APP и другихего фрагментов в развитии нейродегенерации. Долгое время APP рассматривалсяисключительно как источник Аβ. В то же время ряд исследований показывает, чтонарушение нормальной функции APP может также приводить к развитиюразнообразных патологий нервной системы. Определение роли APP в развитиипатологических процессов, наблюдаемых при БА – ключевой момент дляпониманиябазисныхзаболевания,чтомолекулярныхкрайневажномеханизмов,какдляведущихсозданиякразвитиюновыхметодикдиагностирования БА, так и для разработки эффективных методов лечения.Цель исследования.

Цель работы – исследовать эффекты гиперэкспрессиигена АРР в нервной системе Drosophila melanogaster и охарактеризовать влияниесодержания трансгенных особей Drosophila на среде с дрожжами Saccharomycescerevisiae, мутантными по гену ADE2 и продуцирующими красный пигмент, нанейродегенерацию и амилоидогенез.Задачи исследования:1.ПроанализироватьморфологическиедефектыразвитияособейDrosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР, АРР с мутацией Swedish, атакже с образованием Аβ42 в нервных клетках.2.Используя трансгенные линии Drosophila melanogaster изучитьвлияние экспрессии АРР, АРР с мутацией Swedish, последовательностей,9продуцирующих укороченные формы APP, а также образования Аβ42 натранскрипционную активность генов пресинаптических белков.3.Определить влияние содержания особей Drosophila c экспрессиейпоследовательности,кодирующейпептидАβ42,насредесдрожжами-продуцентами красного пигмента на уровень растворимого и агрегированногоАβ42 в мозге мух.4.ИсследоватьвлияниесодержаниятрансгенныхDrosophilamelanogaster на среде с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, продуцирующимикрасный пигмент, на продолжительность жизни и поведение мух.Основные положения, выносимые на защиту.1.Нарушение нормальных функций белка APP ведет к активациииммунного ответа и соответствующей воспалительной реакции, вызывая темсамым патоморфологические дефекты развития и функционирования организмов.2.Нарушение метаболизма APP независимо от Аβ42 влияет насинаптическую плотность в мозге за счет негативной регуляции экспрессии геновсинаптических белков.