Диссертация (1145861), страница 8
Текст из файла (страница 8)
По возможности пробы подбирались таким образом,чтобы их отжиг происходил в местах соединения экзонов. Этим предотвращалосьвозможное искажение получаемых результатов геномной ДНК. Подобранныепраймеры и пробы были произведены фирмами «Бигль» (Санкт-Петербург) и«Синтол» (Москва).Таблица 2.Нуклеотидные последовательности используемых праймеров и пробПрямой праймер5’- CCTGGTCAGCGTTGAAGGA -3'syt1n-sybОбратный праймер5’- GCAGCGAGAAGCAGATATCT -3’ПробаFAM-AGGGCGGACAGGAAA-RTQ1Прямой праймер5’- GGCGGCGTGTAAGCAATC -3'Обратный праймер5’- CCCGCTGAAGGAGCACACTA -3’ПробаpsnRP49GAPDH2FAM-CGCTGCCAGGACGAAAGTTTCTCGARTQ1Прямой праймер5’- TGGACTGCCTGGGCTGTA -3'Обратный праймер5’- TCCTCTTGGCGAAAGGACA -3’ПробаFAM-CTGCCATTTCTATTTGGGATCTT-RTQ1Прямой праймер5’- AGCACTTCATCCGCCACC -3'Обратный праймер5’- CGACGCACTCTGTTGTCG -3’ПробаR6G-CTAAGCTGTCGCACAAATGGCG-BHQ1Прямой праймер5’- TGGCCAAGGTGATCAACGACAA -3'GAPDH2 Обратный праймер5’- ACAACTTGCCGGAAGGTCCAT -3’46ПробаR6G-TGATGACCACCGTTCATGCCACCACCGCTBHQ1Реакционная смесь для проведения амплификации состояла из следующихкомпонентов: 67 мМ Tris-HCl (pH 8.8), 16.6 мM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100,2,5мM MgCl2, 5 мкл смеси четырех dNTP, по 1,5 пмоль каждого праймера и 2,5пмоль флуорогенного зонда, 5 ед.
термостабильной высокопроцессивнойрекомбинантной Taq ДНК полимеразы и 1 мкл кДНК. Перед амплификациейреакционная смесь инкубировалась при 50оС в течение 2-х минут, после чегоследовала денатурация при 950С в течение 10 мин. 1 цикл амплификации состоялиз двух этапов: денатурации при 950С в течение 15 сек и отжига при 600С втечение 1 мин.
Цикл повторялся 50 раз. Для минимизации возможных отклоненийкаждый образец был амплифицирован в трех экземплярах.Пример получаемых в результате амплификации кинетических кривыхпредставлен на рис. 5.Рис. 5. Кинетические кривые кДНК генов syt1 и RP49.47Для всех исследуемых и референсных генов строилась стандартная кривая,используя следующие разведения контрольной кДНК: 1, 1/8, 1/16.На рис. 6 представлен пример стандартных кривых для генов syt1 и RP49Рис. 6.
Стандартные кривые для генов syt1 и RP49Использование различных флуорогенных меток (FAM и RG6) позволилопроводить амплификацию исследуемого и референсного гена в одной пробирке.2.8 Определение статуса метилирования промоторной области генов syt1и n-sybОпределение статуса метилирования промоторной области гена проводилосьпри помощи набора фирмы-производителя Zymo Research OneStep qMethyl™согласно протоколу. Для амплификации фрагментов промоторных областейисследуемых генов были подобраны следующие праймеры:syt1:fwd–ACACGCTCCAGGAGCAGC;GTACGCATGCACCAAAAAAC,rev–48n-syb:fwd–GATCAAACCAAATGTCAACCA,rev–CCCCGTCGTCAATGAAAAT;В наборе используются рестриктазы AccII, HpaII, HpyCH4IV, разрезающиеопытную ДНК около СG-пары только при отсутствии метилирования цитозина вCG-паре.Промоторная область составляла: 396 пар нуклеотидов до старт-кодона дляsyt1 и 634 пары нуклеотидов до старт-кодона для n-syb2.9 Анализ выживаемости трансгенных особей Drosophila melanogaster настадии имагоДля анализа выживаемости использовали имаго Drosophila melanogaster.После вылета трансгенные мухи помещались в пробирки с агаром, содержащиештамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae, продуцирующие красный пигмент.Равное количество мух помещалось в пробирки с агаром, содержащие изогенныйштамм Saccharomyces cerevisiae, не являющийся продуцентом красного пигмента.В каждую пробирку помещалось 30 имаго, на каждый эксперимент бралось неменее 300 мух.
Каждый эксперимент проводили в 3-х повторностях. Мухисодержались при 29oC. Обновление корма проводили каждые два дня.Параллельно с этим фиксировали количество умерших имаго. Каждыйэксперимент продолжался до момента гибели последней мухи. В концеэксперимента определяли показатель средней продолжительности жизни ипоказатель 50% гибели мух.2.10 Определение и анализ уровня нейродегенерации в мозге взрослыхтрансгенных особей Drosophila melanogasterГоловы мух отделяли от тела и помещали в свежеприготовленный фиксаторКарнуа на 24 часа при температуре 4оС.
Далее проводили обезвоживаниепрепарата в 100%-ом этаноле и метиловом эфире бензойной кислоты и заливкуобъектов в парафин. Полученные препараты использовали для приготовленияпарафиновых срезов, толщиной 6 мкм. Далее срезы окрашивали гематоксилиноми эозином и анализировали на световом микроскопе Leica DM 2500. Оценка49степенинейродегенерацииопределялисоотношениепроводиласьплощадиспомощьювакуолейкопрограммывсейImageJ,площадимозга.
Анализировали серии из 16-18 срезов головного мозга 6 мух каждогогенотипа.2.11 Подготовка образцов и проведение конфокальной микроскопии длядетекции амилоида в мозге имаго Drosophila melanogasterДля проведения конфокальной микроскопии головы мух отделяли от тела ипомещали в свежеприготовленный раствор фосфатно-солевого буфера (PBS).Затем фиксировали в растворе 4% параформальдегида (Sigma-Aldrich, США) 7минут при комнатной температуре. После фиксации промывали в PBS и выделялимозг.
Подготовленный мозг заключали в раствор PBS с глицерином всоотношении 1:1.Для детекции Аβ42 использовали моноклональные антитела 6E10 («Covance»,Catalog Number: SIG-39320). И в том и в другом случае использовали вторичныеантитела Cy3 («JaksonImmunoResearch», USA). Конфокальная микроскопия былапроведена с помощью микроскопа Leica TCS SP5 («Leica», Германия) совстроенным 35-мВт аргонным лазером.2.12 Оценка изменения локомоторной активности, способности кобучениюиформированиюпамятитрансгенныхособейDrosophilamelanogaster на стадии имагоОценку изменения локомоторной активности трансгенных мух проводили впластиковом флаконе с нанесенной на расстоянии 9 см от дна отметкой.
20особей помещалось во флакон, флакон встряхивался, в результате чего мухиоказывались на дне. Через 15 секунд подсчитывали количество мух, пересекшихотметку в 9 сантиметров. Каждый эксперимент проводился в 3х повторностях. Вкаждом эксперименте использовали не менее 300 мух.Оценку способности мух к обучению и формированию памяти проводили пометодике, предложенной Тулли и Квином (Tully, Quinn, 1985). Drosophilaобладает хорошо развитой нервной системой и способна обучаться, т.е.50вырабатывать условные рефлексы на те или иные раздражители.
В данном опытемух помещали в трубку, через которую прокачивали воздух с одним из двухнейтральных пахучих веществ (3’-октанол и 4-метилциклогексанол). Трубкаизнутрибылапокрытаметаллическойсеткой,способнойпроводитьэлектрических ток. «Обучение» проводилось в три этапа. На первом этапе мухи втечение 1 минуты получали слабые удары электрическим током в присутствиепервого нейтрального запаха. Затем следовал минутный перерыв.
На последнемэтапе мухи подвергались воздействию второго нейтрального запаха, но уже безэлектрического тока. После этого оценивали способность мух к обучению. Дляэтого мухи помещались в центр трубки, в которой на равном расстоянии отцентра находились перечисленные выше источники запахов. Воздух, нагнетаемыйс обеих сторон выходил через отверстие в центре трубки. Таким образом мухиоказывались между встречными потоками двух запахов. Оценивалось количествомух, сделавших правильный выбор (переместившихся в сторону запаха, которыйнесочеталсясэлектрическимтоком)исделавшихневерныйвыбор(соответственно, в сторону запаха, сочетавшегося с током). Для оценки памятимух подобный эксперимент проводился через 1 час.Используя полученные данные определялся индекс обучаемости и памяти: изчисла мух, сделавших «правильный» выбор (т.е.
выбравших обонятельныйстимул, не совмещенный с электрическим током), вычитали число мух,сделавших «неправильный» выбор. Полученную разность делили на общее числомух и умножали на 100. Схема установки приведена на рис.7.51Рис. 7. Схема установки для тестирования мух на способность к обучению иформированию памяти2.13 Измерение уровня белков в мозге трансгенных особей DrosophilamelanogasterДля выделения белка использовали 30 голов 20-дневных мух нужногогенотипа. Мух замораживали в жидком азоте, после чего отделяли головы спомощью вортексирования. Головы гомогенировали в растворе, содержащемPBS, 1% SDS и ингибиторы протеаз (фирма Roche).
Гомогенат центрифугировалипри скорости 14000g в течение 2х минут, получившийся супернатант отделяли ииспользовали для измерения уровня растворимого Aβ. Осадок дополнительнорастворяли в лизирующем буфере, содержащем мочевину (9M мочевина, 1% SDS,25 мМ Tris HCl, 1 мМ EDTA), получившийся раствор выдерживали в течение 1часа при 55°C. Затем раствор центрифугировали при 14000g в течение 2х минут иотбирали супернатант, который затем использовался для измерения уровнянерастворимого Aβ.Количествоиспользованиемобщегобелкаопределялиспециализированногоспекртофотометре («Hitachi», Japan).наборапометоду(«Силекс»,БредфордасРоссия)на52Уровень Aβ в мозге мух определялся с помощью метода вестерн блоттинга.Подготовка проб для электрофореза производилась следующим образом: кбелковым пробам добавлялся буфер Лаемли (200мМ Tris-HCl pH 6,8, 400 мМ βмеркаптоэтанол, 4% додецилсульфат, 0,01% бромфенол, 40% гицерол) всоотношении 1 объем буфера к 2 объемам белка. Получившийся раствор грелипри 100°C в течение 5 минут.
Для проведения электрофореза получившиесяпробы наносили на 12% полиакриламидный гель (SDS-PAGE) в объеме,содержащем равное количество общего белка. Электрофорез проводился в 1Хтрис-глициновом буфере (5мM Tris-HCl pH 8,8, 50 мM глицина (pH 8,3), 0,1 %додецилсульфата).Перенос белков с полиакриламидного геля на PVDF мембрану (ThermoScientific, США) производился с помощью прибора для полусухого переносабелка (Bio-Rad, США). Для переноса использовался следующий буфер дляпереноса: 39 mM глицина, 48 мМ Tris-HCl pH 8,8, 0,037 % додецилсульфата, 20 %метанола.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
