Диссертация (1145861), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Сучетом того, что использованный в эксперименте набор Zymo Research позволялопределить статус метилирования цитозина только в парах CG, это можетобъяснитьналичиеростауровняметилированияпромоторнойисследуемых генов при отсутствии статистической достоверности.области743.4Изучение влияния содержания взрослых особей Drosophilamelanogaster c экспрессией последовательности, кодирующей пептид Аβ42, насреде с дрожжами-продуцентами красного пигмента на амилоидогенез инейродегенеративные процессы в мозге мухСогласно наиболее популярной сегодня «амилоидной гипотезе» [Hardy,Higgins, 1992], нарушение синаптических функций в мозге, лежащее в основепотери памяти при БА, является результатом действия растворимых олигомеровАβ [Ferreira, Klein, 2011].
Несмотря на описание других механизмов, возможноперекрывающихся с образованием Аβ, включающих воспаление [Galimberti et al.,2008], окислительный стресс [Reddy et al., 2009], нарушение метаболизмахолестерина [Stefani, Liguri, 2009] и нарушение нормальных клеточных функцийбелков, замещения в которых приводят к развитию БА [Saura et al., 2004; Sarantsevaet al., 2009], основные стратегии разработки терапии для БА в последние годы былисконцентрированы на поиске соединений, снижающих уровень Аβ [Giacobini,Becker, 2007]. Следовательно, терапия при БА должна восстанавливать гомеостазАβ в мозге, который может быть нарушен в результате изменений в образовании иклиренсе Аβ [Hardy, Higgins, 1992; Hardy, 2002; Hardy, 2006].За годы исследований более чем 100 потенциальных антиамилоидогенныхсоединений были изучены в клинических исследованиях [Becker et al., 2008;Becker, Greig, 2010, 2012].
Однако ни одно из исследуемых соединений не быловведено в практику по различным причинам, начиная от слабой эффективности изаканчивая сильными побочными эффектами. Тем не менее на сегодняшний деньясно, что антиамилоидогенная терапия войдет в комплексную лекарственнуютерапию при БА.В данной работе мы оценили влияние содержания взрослых особейDrosophila melanogaster c экспрессией последовательности, кодирующей пептидАβ42, на среде с дрожжами-продуцентами красного пигмента на амилоидогенез инейродегенеративные процессы в мозге мух75Известно, что мутации в генах ADE-1 и/или ADE-2 приводили к накоплениювцитоплазмеклетокдрожжейSaccharomyces5’-cerevisiaeаминоимидазолрибозида, который, после полимеризации и присоединениянекоторых аминокислот, образует красный пигмент, в результате колониимутантныхдрожжейприобретаютхарактернуюкраснуюокраску.Былообнаружено, что дрожжи красного штамма имеют значительно сниженныйуровень общего амилоида по сравнению с «белыми» дрожжами.
Интересно, чтоштамм дрожжей, изогенный красному штамму, несущий дополнительнуюмутацию в гене ADE6, блокирующую синтез аденина на ранней стадии, и необразующий в результате этого красный пигмент, имел значительно болеевысокийуровеньобщегоамилоида.Этопозовляетсделатьвыводобантиамилоидных свойствах красного пигмента. Было также показано, чтодобавление красного пигмента к разрушенным клеткам «белого» штамма,снижало уровень общего амилоида, из чего можно сделать вывод обэффективности красного пигмента in vitro. В другом опыте антиамилоидныйэффект красного пигмента был показан на фибриллах инсулина.
В определенныхусловиях мономеры инсулина способны агрегировать и образовывать фибриллы.Осветленный дрожжевой лизат, содержащий красный пигмент, добавляли кфибриллам инсулина. Эффект анализировали путем определения уровняфлуоресценции тиофлавина Т, способного связываться с амилоидизированнымибелками. Было выявлено значительное снижение уровня флуоресценции в пробахс добавленным красным пигментом по сравнению с пробами, в которые былдобавлен лизат, полученный из изогенного «белого» штамма [Nevzglyadova et al.,2011, Михайлова и др., 2011]. Кроме того, добавление чистого экзогенногокрасного пигмента к трансформированным дрожжам, в которых происходитобразование Аβ, существенно снижало содержание Аβ в лизатах, что былопоказано как с помощью анализа уровня флуоресценции тиофлавина Т, так и спомощью вестерн блоттинга [данные готовятся к публикации].76Приведенные выше данные, а также тот факт, что дрожжи служатприродным кормом для плодовой мушки стали основой эксперимента по оценкевлияния красного пигмента на амилоидизацию в Drosophila melanogaster.Трансгенные Drosophila melanogaster с экспрессией последовательностичеловеческого Аβ42 в нервных клетках – широко используемый инструмент дляизучения патогенеза Аβ in vivo.
Было показано, что экспрессия Аβ в нейронахмозга приводила к прогрессирующей с возрастом нейродегенерации, нарушениямлокомоторных функций и преждевременной гибели мух. Так как дрожжи служатприродным кормом для плодовой мушки, для проведения эксперимента былодостаточно содержать трансгенных мух на среде с «красным» и «белым»изогенными штаммами дрожжей и сравнить их по проявлению перечисленныхвыше черт патогенеза.3.4.1 Изучение влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на амилоидогенез в мозгевзрослых мухБыло оценено влияния потребления красного штамма дрожжей насодержание Аβ в мозге имаго трансгенных особей Drosophila с экспрессиейпоследовательности, кодирующей Аβ42.С помощью иммуногистохимии и конфокальной микроскопии былозафиксировано отложение Аβ в мозге трансгенных мух.
Пример опытапредставлен на рис. 19.77Рис. 19. Детекция отложения Аβ в мозге мух; А - elav/+; Аβ/+ ( белые»дрожжи), Б - elav/+; Аβ/+ («красные» дрожжи), В - контроль elav/+;+ («белые»дрожжи), Г – контроль elav/+;+ («красные» дрожжи).Как видно из приведенного выше рисунка, Аβ детектировался только вмухах с образованием Аβ42, в контрольной линии сигнал отсутствовал.Для количественной оценки содержания Аβ было проведено измерение егоуровня в мозге мух, потреблявших в пищу как «красные» дрожжи, так и «белые»,не продуцирующие красный пигмент, дрожжи, используя метод вестернблоттинга.
Относительное содержание Аβ было нормировано на α-tubulin.Пример вестерн блота приведен на рис. 20 и рис. 21.Рис. 20. Результаты вестерн блота на растворимую фракцию Аβ. 1 –контроль elav/+;+ («красные» дрожжи), 2 - контроль elav/+;+ («белые» дрожжи), 3–elav/+; Аβ/+ ( «красные» дрожжи), 4 –elav/+; Аβ/+ ( «белые» дрожжи)78Рис. 21. Результаты вестерн блота на нерастворимую фракцию Аβ. 1 –контроль elav/+;+ («красные» дрожжи), 2 - контроль elav/+;+ («белые» дрожжи), 3–elav/+; Аβ/+ ( «красные» дрожжи), 4 –elav/+; Аβ/+ ( «белые» дрожжи)В мухах, потреблявших в пищу «красные» дрожжи, относительноесодержание растворимой фракции Аβ42 составило 0,095±0,04, «белые» дрожжи –0,31±0,04. Подобные результаты были получены и для нерастворимой фракции.
Вэтом случае содержание нерастворимой фракции Аβ42 в мозге мух, потреблявших«красные» дрожжи составило 0,16±0,06, «белые»– 0,58±0,13.Рис. 22. Результаты вестерн блота. А – растворимая фракция Аβ, Б –нерастворимая фракция Аβ, 1 – elav/+; Аβ/+ ( «красные» дрожжи), 2 – elav/+;Аβ/+ ( «белые» дрожжи)79Чтобы удостовериться, что наблюдаемый нами эффект не являетсяследствием общего угнетения транскрипционной активности в результатепотребления пигментобразующих дрожжей и/или негативной регуляции системыGAL4-UAS, мы провели схожий эксперимент на трансгенных особей Drosophila сэкспрессией гена белка GFP.
В эксперименте использовались мухи, полученные врезультате скрещивания линии elav-GAL4 и линии UAS-GFP. Было показано, чтоуровень GFP в мозге 20-дневных мух, потреблявших в пищу «красные» дрожжине отличался от такового в мухах, развивавшихся на «белом» штамме (рис. 23).Относительное содержание GFP было нормировано на α-tub.Рис. 23. Уровень GFP не менялся вне зависимости от штамма дрожжей. А –относительное содержание GFP в мозге Drosophila, Б – пример вестерн блота. 1 –elav/+; GFP/+ ( «красные» дрожжи), 2 – elav/+; GFP/+ ( «белые» дрожжи)Таким образом, мы показали достоверное снижение уровня Аβ42 в мозгемух, потреблявших в пищу дрожжи-продуценты красного пигмента. Согласноработам Yerbury et al.
в агрегировании олигомеров Аβ и стабилизации агрегатовсущественную роль играют белки-шапероны. Например, одним из участников80патологического процесса является белок кластерин, обнаруживаемый всущественном количестве в амилоидных бляшках. Этот белок-шаперон,связываясь с Аβ, усиливает аггрегационный потенциал пептида.
Любопытно, чтоподобный негативный эффект кластерина наблюдается только при аномальновысоком образовании Аβ. Нарушение связи кластерина с Аβ замедляетдальнейшее отложение амилоида. Возможно, наблюдаемый нами позитивныйэффект содержания трансгенных мух на «красных дрожжах» объясняется именнонарушением связи кластерина с Аβ за счет конкурентного связывания красногопигмента с Аβ, что было описано ранее в работе Nevzglyadova et al.3.4.2 Изучение влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на нейродегенерацию в мозгевзрослых мухНа следующем этапе мы оценили нейропротекторный эффект кормлениятрансгенных мух штаммом-продуцентом красного пигмента.Нейродегенерация,вызываемаяАβ42,проявляетсяввидехаотичнорасположенных вакуолей округлой формы в нейропиле и в районе клетокКеньона.
Оценка уровня нейродегенерации проводилась на 30 день жизнитрансгенных особей (рис. 24).81Рис. 24. Эффект содержания трансгенных особей Drosophila на среде скрасным штаммом дрожжей на нейродегенерацию. А – уровеньнейродегенерации, Б – срезы мозга. Стрелками указаны места вакуолизации. 1 –контроль elav/+;+ («белые» дрожжи), 2 - контроль elav/+;+ («красные» дрожжи), 3–elav/+; Аβ/+ ( «белые» дрожжи), 4 –elav/+; Аβ/+ ( «красные» дрожжи)Нейродегенерация – нормальный процесс старения мозга, что объясняетналичие вакуолей в мозге мух контрольных линий.Из приведенных выше данных видно, что потребление трансгеннымиособями«красных»дрожжейэффективноснижалонейродегенеративныепроцессы, вызываемые экспрессией последовательности, кодирующей Аβ42, вмозге мух.823.4.3Анализвлиянияпотреблениякрасногоштаммадрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на выживаемость взрослыхмухОценка выживаемости проводилась на трансгенных мухах, в мозге которыхпроисходит образование Аβ42.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
