Диссертация (1145861), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Подобные изменения плотности пресинаптических белков вызывалидостоверное ухудшение памяти и способности к обучению, что было показано спомощью теста Тулли и Квина [Sarantseva et al., 2009]. Оставалось, однако,неясным, какой механизм определяет снижение уровня синаптических белков вмозге трансгенных особей Drosophila.3.2.1 Изменение уровня мРНК генов syt1 и n-syb в мозге взрослыхтрансгенных особей DrosophilaМы оценили изменение транскрипции генов синаптических белков syt1 и nsyb как при образовании Aβ, так и при экспрессии полноразмерного APP иразличных его форм. Это позволило нам разделить патологический эффект,оказываемый Аβ от эффекта, оказываемого непосредственно APP или егоформами. Необходимо отметить, что в линиях с экспрессией генов, кодирующихукороченные формы APP, не происходит образования Aβ (из-за отсутствия бетасекретазы), но образуются С-концевые фрагменты APP.Мы экспрессировали APP, его мутантную форму APP-Swedish, приводящуюк семейной форме заболевания, его укороченные формы, а также ген BACE внервных клетках Drosophila melanogaster.
Уровень мРНК генов syt1, n-sybанализировали у 2-дневных и 30-дневных мух следующих генотипов: elav (вкачестве контроля), elav;APP, elav;APP-Swedish, elav;APPΔCT, elav;APPΔNT,elav;APP/BACEиelav;BACE;APP-Swedish.Полученныеданныенормированы относительно контрольной линии с экспрессией гена elav.были66Значения уровня мРНК гена syt1, нормированного на соответствующиепоказатели для референсных генов RP-49 и GAPDH2, на 2й и на 30й деньпредставлены на рис. 14.Рис. 14.
Относительный уровень мРНК гена syt1. 1-elav; 2-elav;APP, 3elav;APP-Swedish, 4-elav;APPΔCT, 5-elav;APPΔNT, 6-elav;APP/BACE и 7elav;BACE;APP-Swedish; *-статистически достоверное отличие P≤0.05; **статистически достоверное отличие P≤0.001.Полученные данные по измерению уровня мРНК гена syt1 демонстрируютего существенное статистически значимое падение уже на 2-й день жизни мух вовсех использованных при исследовании трансгенных линиях как с экспрессиейотдельно APP и его форм, так и образующих Aβ. Подобная же картинасохранялась и для мух на 30-й день их жизни, за исключением линии сэкспрессией укороченной формы APPCT и APPNT, для которых, несмотря на67уменьшение значений уровня экспрессии, не наблюдалось статистическизначимых изменений.Мы также наблюдали падение уровня мРНК гена n-syb (рис. 15).Рис.
15. Относительный уровень мРНК гена n-syb. 1-elav; 2-elav;APP, 3elav;APP-Swedish, 4-elav;APPΔCT, 5-elav;APPΔNT, 6-elav;APP/BACE и 7elav;BACE;APP-Swedish; *-статистически достоверное отличие P≤0.05; **статистически достоверное отличие P≤0.001.На 2-й день статистически значимое уменьшение уровня экспрессии мынаблюдали для всех линий, однако на 30-й день жизни мух статистическизначимое уменьшение было зафиксировано только для линий с экспрессией APPи его мутантной формы APP-Swedish. В линиях же, образующих Aβ либоукороченные формы APP, падение уровня мРНК гена n-syb не наблюдалось.68Для оценки влияния гиперэкспрессии исследуемых генов белков человека напрофиль генной экспрессии мы исследовали изменения уровня мРНК гена psnDrosophila (рис.
16). Мы показали отсутствие статистически значимых измененийуровня м-РНК гена psn у 2-х-дневных мух и увеличение уровня экспрессии у 30дневных, что демонстрирует отсутствие негативного эффекта от APP и Aβ напрофиль экспрессии генов.Рис. 16. Относительный уровень мРНК гена psn. 1-elav; 2-elav;APP, 3elav;APP-Swedish, 4-elav;APPΔCT, 5-elav;APPΔNT, 6-elav;APP/BACE и 7elav;BACE;APP-Swedish; *-статистически достоверное отличие P≤0.05; **статистически достоверное отличие P≤0.001.Любопытно, что экспрессия другого гена трансмембранного белка человекапресенилина 1 (PSEN-1) и его мутантных форм в мозге мух не вызывала падениетранскрипционной активности исследуемых генов синаптических белков.
Были69исследованы трансгенные Drosophila с экспрессией дикого типа PSEN-1 и двухего мутантных вариантов, приводящих к развитию семейной формы БА (рис. 17,рис. 18).Рис. 17. Относительный уровень мРНК гена syt1. A – syt1/RP49 1-2д., Б –syt1/RP49 30д., В – syt1/GAPDH2 1-2д., Г – syt1/GAPDH2 30д.; 1-elav; 2elav;PSEN1,3-elav;PSEN1-M146V,4-elav;PSEN-P267S;*-статистическидостоверное отличие P≤0,05; **- статистически достоверное отличие P≤0,001.70Рис. 18. Относительный уровень мРНК гена n-syb. A – syt1/RP49 1-2д., Б –syt1/RP49 30д., В – syt1/GAPDH2 1-2д., Г – syt1/GAPDH2 30д.; 1-elav; 2elav;PSEN1,3-elav;PSEN1-M146V,4-elav;PSEN-P267S;*-статистическидостоверное отличие P≤0,05; **- статистически достоверное отличие P≤0,001.Как видно из приведенных выше данных экспрессия PSEN-1 и его форм невызывала драматического изменения уровня мРНК исследуемых синаптическихгенов, обнаруживаемого при экспрессии APP и/или образовании Аβ.
Более того,экспрессия PSEN-1 с мутацией M146V приводила к увеличению мРНКпресинаптических белков. Тот факт, что экспрессия PSEN-1 в мозге мух несопровождалась изменениями экспрессионного паттерна синаптических белков,подтверждает «индивидуальность» эффекта гиперэкспрессии АРР в мозгеDrosophilaипоказываетмногообразиепроцессов,ведущихкнейродегенеративным изменениям.Таким образом, мы показали, что гиперэкспрессиия АРР изменяет уровеньмРНК syt1 и n-syb. Полученные данные указывают на его существенное падение71уже на 2-й день жизни мух во всех исследованных трансгенных линиях сэкспрессией как APP и его форм, так и в линиях с образованием Aβ (совместнаяэкспрессия АРР и ВАСЕ), Подобная картина сохранялась и на 30-й день для syt1,за исключением линий с экспрессией укороченных форм APPCT и APPNT.Интересно, что на 30-й день уровень мРНК n-syb снижался только в линиях сэкспрессией полноразмерного АРР (АРР и АРР-Sw).
Как было отмечено ранее,трансгенные линии Drosophila позволяют разделить эффекты АРР и A. Мыполагаем, что наблюдаемое снижение уровня мРНК syt1 и n-syb обусловленоэкспрессией именно гена АРР независимо от секреции Аβ. Хотя нашиэксперименты были проведены на трансгенных организмах, в литературепредставлены данные о том, что дупликации гена АРР может приводить кразвитию БА [Rovelet-Lecrux et al., 2006].Можно предположить, что важную роль в изменении уровня экспрессиипресинаптических генов может играть С-концевой фрагмент белка APP – AICD,небольшой пептид размером в 6-kDa, отщепляющийся в результате действиягамма-секретазы.
Показано, что AICD, может проникать в ядро, связываться сразличными внутриклеточными адпторными белками, влияя через них на многиеклеточныепроцессы,вчастностигеннуюэкспрессию,синаптическуюпластичность и память [Kim et al., 2003; Muller et al., 2007; Cao, Sudhof, 2001; Gao,Pimplikar, 2001]. С другой стороны, не только фрагменты АРР, но и он сам можетучаствовать в регуляции транскрипции. Так гиперэкспрессия АРР в нейронахуменьшала уровень мРНК белков, участвующих в обороте холестерина (SREBP,HMGCR, cholesterol 24‐hydroxylase) [Pierrot et al., 2013].Таким образом, нарушения процессов транскрипции генов синаптическихбелков могут лежать в основе изменения синаптической плотности, наблюдаемойпри БА и являются одним из ранних признаков заболевания.
Изменениеэкспрессии гена АРР или мутации в нем могут приводить к уменьшению уровнямРНК синаптических белков и вызывать синаптическую патологию при БА.723.3 Метилирование ДНК как один из факторов, регулирующихактивность генов синаптических белков в трансгенных особях DrosophilaОдной из причин изменения транскрипционной активности генов можетбыть изменение статуса метилирования промоторной области исследуемых генов.Эпигенетическая регуляция активности генома путем метилирования остатковцитозина – широко распространенное в природе явление, наблюдаемое у многихпредставителейэукариот.Долгоевремясчиталось,чтоуDrosophilaметилирование ДНК либо отсутствует полностью, либо не играет существеннойроли в регуляции активности генов.
В основном это объяснялось отсутствием уDrosophila гомологов канонических метилтрансфераз человека. Кроме того, небыло показано наличие 5-метилцитозина в геноме Drosophila [Kunert et al, 2003;Gowher et al., 2000]. Однако, последние исследования показали, что геномDrosophilaсодержитгенMT-2,которыйкодируетбелок,обладающийметилтрансферазной активностью [Kunert et al, 2003]. Более сложный анализ ДНКпозволил также обнаружить метилированный цитозин в ДНК, полученной наразных этапах развития Drosophila, в том числе и на стадии имаго, где онобнаруживается в концентрации 1 метилированный цитозин на 1000-2000неметилированных [Gowher et al., 2000]. Таким образом, несмотря на не стольмасштабный уровень метилирования генома Drosophila по сравнению смлекопитающими,даннаяэпигенетическаярегуляцияможетвлиятьнатранскрипционную активность генов.Мы предположили, что именно изменение статуса метилирования геномаDrosophila при гиперэкспрессии APP и образовании Аβ ответственно за угнетениетранскрипционной активности исследуемых генов.Мы оценили изменение статуса метилирования промоторных областейисследуемых генов.
Статус метилирования гена syt1 на 2-й и 30-й деньпредставлены в таблице 3.73Таблица 3Статус метилирования гена syt1, %ГенотипДни1-2 дня (%)30 дней (%)elav/+ (контроль)100±3100±2elav;APP119±5*118±3*elav;APP-Swedish116±2*119±5*elav; APPΔCT109±4118±9elav; APPΔNT114±3*106±2elav;BACE/APP105±3108±3elav;BACE;APP-Sw110±4101±4* - статистически достоверное отличие P≤0.05;Из табл. 3 видно, что статус метилирования промоторной области гена syt1на 2-й день после вылупления имеет тенденцию к росту во всех исследуемыхлиниях со статистически значимыми изменениями в линиях с экспрессией APP,APP-Swedish и APPΔNT, что коррелирует с данными по экспрессии этого гена.Подобная тенденция сохраняется и на 30 день жизни мух.Несмотря на незначительный рост уровня метилирования промоторнойобласти гена n-syb, полученный в эксперименте, мы не наблюдали статистическизначимых изменений ни на 2-й, ни на 30-й день.Необходимо отметить, что у Drosophila могут быть метилированы не толькоцитозины в CG-паре, но и цитозины в парах CA и CT [Ramsahoye et al., 2000].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
