Диссертация (1145861)
Текст из файла
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР "КУРЧАТОВСКИЙИНСТИТУТ" ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕУЧРЕЖДЕНИЕ ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ ЯДЕРНОЙ ФИЗИКИ ИМ. Б.П.КОНСТАНТИНОВАНа правах рукописиРОДИН Дмитрий ИгоревичЭффекты гиперэкспрессии гена белка предшественника амилоида внервных клетках дрозофилы и поиск антиамилоидогенных соединений03.02.07 – генетикаДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:доктор биологических наукСаранцева С.В.Cанкт-Петербург20142Список сокращений………………………………………………………........5Введение…………………………………………………………………………61. Обзор литературы…………………………………………………………..121.1 Нейродегенеративные заболевания…………………………………..121.2 Болезнь Альцгеймера (БА): клиническая и патоморфологическаясимптоматика, диагностика и лечение…………………………………...121.2.1 Патоморфологические и патогистологические признакиБА…………………………………………………………………………...141.2.2 Семейные и спорадические формы БА………………….................181.2.3 Участники патологических процессов при БА…………................221.3 Эпигенетика и БА……………………………………………………...251.3.1.
Эпигенетическая модификация гистонов при БА……………261.3.2 Метилирование ДНК при БА…………………………………..261.3.3 Роль микроРНК в БА……………………………………….......271.4ЛечениеБА:существующиелекарственныепрепаратыипрепараты, находящиеся в разработке…………………………………...281.5 Моделирование основных признаков БА на животных…………….362. Материалы и методы………………………………………………….......402.1 Линии мух, использованные в работе, и условия их содержания…402.2 Анализ выживаемости трансгенных особей Drosophila melanogasterна стадии куколки………………………………………………………….422.3 Приготовление образцов для микроскопии морфологическихизменений внешних органов и ротового аппарата трансгенных особейDrosophila melanogaster на стадии имаго………………………………..432.4 Оценка количества морфологических аномалий в трансгенныхособях Drosophila melanogaster…………………………………………..432.5 Выделение РНК………………………………………………………..442.6 Обратная транскрипция…………………………………………….....4432.7 Проведение ПЦР в реальном времени…………………………….....442.8 Определение статуса метилирования промоторной области геновsyt1 и n-syb…………………………………………………………………472.9 Анализ выживаемости трансгенных особей Drosophila melanogasterна стадии имаго…………………………………………............................482.10 Определение и анализ уровня нейродегенерации в мозге взрослыхтрансгенных особей Drosophila melanogaster…………………………….
482.11 Подготовка образцов и проведение конфокальной микроскопиидля детекции амилоида в мозге имаго Drosophila melanogaster…….....492.12 Оценка изменения локомоторной активности, способности кобучению и формированию памяти трансгенных особей Drosophilamelanogaster на стадии имаго………………………………………….....592.13 Измерение уровня белков в мозге трансгенных особей Drosophilamelanogaster………………………………………………….....................512.14 Статистическая обработка данных……………………………….....533. Результаты и обсуждение………………………………………………....543.1 Аномалии развития Drosophila с гиперэкспрессей гена APP и собразованием Аβ…………………………………………………………..543.1.1 Выживаемость на стадии куколки трансгенных особейDrosophila c гиперэкспрессией гена APP человека и образованиемАβ……………………………………………………………………..3.1.2МорфологическиеизмененияимагоDrosophila54cгиперэкспрессией гена APP человека и образованием Аβ……......553.1.3 Распределение морфологических аномалий имаго Drosophilaв зависимости от генотипа исследуемых мух………………………593.2 Транскрипционные изменения генов синаптических белков в мозгевзрослых мух при гиперэкспрессии APP и образовании Аβ ..................633.2.1 Изменение уровня мРНК генов syt1 и n-syb в мозге взрослыхтрансгенных особей Drosophila ……………..……………………..3.3 Метилирование ДНК как один из факторов, регулирующих654активность генов синаптических белков в трансгенных особяхDrosophila………………………………………………………………......723.4 Изучение влияния содержания взрослых особей Drosophilamelanogaster c экспрессией последовательности, кодирующей пептидАβ42, на среде с дрожжами-продуцентами красного пигмента наамилоидогенезинейродегенеративныепроцессывмозгемух………………………………………………………………………….743.4.1 Изучение влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на амилоидогенезв мозге взрослых мух…………………………………………………763.4.2 Изучение влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгеннымиособямиDrosophilamelanogasterнанейродегенерацию в мозге взрослых мух………………………......803.4.3 Анализ влияния потребления красного штамма дрожжейтрансгенными особями Drosophila melanogaster на выживаемостьвзрослых мух……………………………………..................................
823.4.4 Анализ влияния потребления красного штамма дрожжей налокомоторные функции, способность к обучению и памятьтрансгенных особей Drosophila melanogaster ……………………… 83Выводы………………………………………………………………………......85Список литературы………………………………………………………......86Благодарности…………………………………………………………............... 1045СПИСОК СОКРАЩЕНИЙБА – болезнь АльцгеймераAPP – белок предшественник амилоидаPSEN – пресенилин человекаpsn – дрозофильный гомолог PSEN человекаАβ – амилоидный пептид βНЗ – нейродегенеративные заболеванияNMDA – N-метил-D-аспартатAMPA – альфа-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовая кислотаАРОЕ – аполипопротеин ЕBACE – бета-секретазаGWAS – полногеномный поиск ассоциацийSMSSE – Standardized Mini-Mental State Examination – тест, направленный навыявление когнитивных расстройствADAS (Alzheimer Disease Assessment Scale – усовершенствованный аналогSMMSE)GFP – зеленый флуоресцентный белокRP-49 – рибосомальный протеин L32GAPDH2 – глицеральдегид 3 фосфат дегидрогеназа 2syt1 – синаптотагмин-1n-syb – нейрональный синаптобревинtau – ассоциированный с микротрубочками белок тау6ВведениеАктуальностьпроблемы.Белок-предшественникамилоида(APP)–крупный трансмембранный белок, в большом количестве обнаруживаемый всинапсах нейронов.
Этот белок принимает участие в развитии различныхзаболеваний, среди которых можно выделить синдром Дауна, амилоиднуюангиопатию и болезнь Альцгеймера. На сегодняшний день функции АРР неясны.Однако было показано, что он участвует в разнообразных процессах,включающих клеточную адгезию, клеточную сигнализацию, формированиеструктуры и функций нейронов [Breen et al., 1991; Neve et al., 2007; Stante et al.,2009].Основным механизмом протеолиза APP является его расщепление тремяпротеазами, получившими название α-, β- и γ-секретаз. Процессинг APPосуществляется по так называемому амилоидогенному (при участии β- и γсекретазы) и неамилоидогенному пути (соответственно, при участии α- и γсекретазы).
Основным отличием амилоидогенного пути от неамилоидогенногоявляется образование в результате расщепления APP небольшого по размерамамилоидного пептида–бета (Аβ). В свою очередь, нарушение метаболизма Аβприводит к его агрегированию и образованию так называемых сенильных бляшек-одногоизглавныхмаркеровширокораспространённогостарческогонейродегенеративного заболевания - болезни Альцгеймера (БА).БА - одна из значимых медицинских проблем современного мира. Развитиеклассической альцгеймеровской симптоматики обычно начинается после 65 лет.После этого возраста риск заболевания удваивается каждые пять лет и уже к 80годам частота заболевания доходит до 25%.
Кроме того, существует и ранняяформа заболевания, поражающая людей в возрасте от 30 до 50 лет. По оценкамВсемирной организации здравоохранения, в мире около 30 миллионов человекстрадает этим заболеванием.БА характеризуется тяжелой и разнообразной симптоматикой, включающейамнезию, зрительно-пространственные и временные нарушения, алексию,7аграфию. Дальнейшее прогрессирование заболевания ведет к полной афазии,оральным и хватательным автоматизмам, насильственному смеху и плачу,общему физическому истощению и, в конечном итоге, к летальному исходу.На сегодняшний день не существует эффективного способа лечения БА. Загоды исследований заболевания было протестировано и отвергнуто множествопрепаратов. В большей степени это связано с отсутствием глубинного пониманиямеханизмов, ведущих к развитию патологии. Тем не менее, с каждым годом числотестируемых препаратов растет.
Наиболее перспективными являются соединения,обладающие антиамилоидогенной активностью, т.е. способные восстанавливатьгомеостаз Аβ.Диагностирование заболевания на сегодняшний момент осложнено в связи сотсутствием прижизненных маркеров и точная постановка диагноза возможналишь в результате посмертной аутопсии мозга. Аутоптат мозга пациентов обычновыявляет наличие классических маркеров БА – деградацию тканей мозга иналичие амилоидных бляшек и нейрофибриллярных клубков.Согласно гипотезе амилоидного каскада токсичные растворимые формы Аβзапускают множество разнообразных процессов, включающих нарушениеэнергообмена, разрушение структуры цитоскелета и воспаление, что в итогеприводят к дисфункции нейронов, нарушению синаптической передачи икогнитивным изменениям.
Несмотря на наличие множества данных, бесспорноподтверждающих правомерность амилоидной гипотезы, более пристальноеизучение вопроса последних лет показало, что не только вызываемый Аβ каскадпатологических изменений, но и ряд других не связанных или опосредованносвязанных с Аβ параллельных процессов может вести к манифестацииклинической симптоматики заболевания. Среди этих процессов можно выделитьпатологические изменения цитоскелета нейрона, нарушение антиоксидантнойсистемы, нарушение апоптоза, изменение клеточного метаболизма и др.
[Brion,1998; Peers et al., 2007; Kumar-Singh, 2008; Kroner, 2009; Su et al., 2008, BermejoPareja et al., 2010].8БА с ранним началом в основном имеет семейный анамнез и обуславливаетсямутациями в генах, кодирующих APP, PSEN-1 (пресенилин-1) и PSEN-2(пресенилин-2). В то же время причины спорадических случаев заболевания досих пор неясны. Современные методы молекулярно-генетических исследований,например,полногеномныйпоискассоциаций,продемонстрировалимногофакторность БА.
Был выделен ряд генов, мутации в которых ассоциированыс заболеванием, однако роль кодируемых ими белков в нейродегенеративномпроцессе неочевидна. [Dreses-Werringloer et al., 2008; Kan et al., 2005; Liu et al.,2013].Кроме того не до конца ясна функция полноразмерного белка APP и другихего фрагментов в развитии нейродегенерации. Долгое время APP рассматривалсяисключительно как источник Аβ. В то же время ряд исследований показывает, чтонарушение нормальной функции APP может также приводить к развитиюразнообразных патологий нервной системы. Определение роли APP в развитиипатологических процессов, наблюдаемых при БА – ключевой момент дляпониманиябазисныхзаболевания,чтомолекулярныхкрайневажномеханизмов,какдляведущихсозданиякразвитиюновыхметодикдиагностирования БА, так и для разработки эффективных методов лечения.Цель исследования.
Цель работы – исследовать эффекты гиперэкспрессиигена АРР в нервной системе Drosophila melanogaster и охарактеризовать влияниесодержания трансгенных особей Drosophila на среде с дрожжами Saccharomycescerevisiae, мутантными по гену ADE2 и продуцирующими красный пигмент, нанейродегенерацию и амилоидогенез.Задачи исследования:1.ПроанализироватьморфологическиедефектыразвитияособейDrosophila melanogaster с гиперэкспрессией гена АРР, АРР с мутацией Swedish, атакже с образованием Аβ42 в нервных клетках.2.Используя трансгенные линии Drosophila melanogaster изучитьвлияние экспрессии АРР, АРР с мутацией Swedish, последовательностей,9продуцирующих укороченные формы APP, а также образования Аβ42 натранскрипционную активность генов пресинаптических белков.3.Определить влияние содержания особей Drosophila c экспрессиейпоследовательности,кодирующейпептидАβ42,насредесдрожжами-продуцентами красного пигмента на уровень растворимого и агрегированногоАβ42 в мозге мух.4.ИсследоватьвлияниесодержаниятрансгенныхDrosophilamelanogaster на среде с дрожжами Saccharomyces cerevisiae, продуцирующимикрасный пигмент, на продолжительность жизни и поведение мух.Основные положения, выносимые на защиту.1.Нарушение нормальных функций белка APP ведет к активациииммунного ответа и соответствующей воспалительной реакции, вызывая темсамым патоморфологические дефекты развития и функционирования организмов.2.Нарушение метаболизма APP независимо от Аβ42 влияет насинаптическую плотность в мозге за счет негативной регуляции экспрессии геновсинаптических белков.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
