Автореферат (Сигнальная регуляция развития симбиоза гороха Pisum sativum L. с клубеньковыми бактериями), страница 9

2010). Следовательно, специфичные для клубеньков CLEпептиды могут работать сходным образом у разных бобовых.Нами был также проведен анализ влияния сверхэкспрессии MtCLE13 нафенотип суперклубенькообразующих мутантов гороха P88 (sym29) и P64 (sym28). Вотличие от растений исходной линии Frisson, у которой при сверхэкспрессии CLEпептида наблюдалось значительное уменьшение количества образующихсяклубеньков, на корнях мутантов sym29 (нарушения в CLV1-подобном гене) и sym28(мутация в CLV2 гене), содержащих конструкцию 35S::MtCLE13, формировалосьзначительное количество клубеньков, также как и в контроле (GUS-OE) (рисунок27) (Osipova et al., 2012).

Следовательно, влияние сверхэкспрессии MtCLE13 (CLEOE) не проявлялось в корнях мутантов по генам, кодирующим компонентыпобеговой системы авторегуляции.Рисунок 27. Суперклубенькообразующий фенотип трансгенных корнеймутантов sym29 (A, B) и sym28 (C, D) со сверхэкспрессией MtCLE13 (Osipova etal., 2012).Полученные данные об отсутствии влияния сверхэкспрессии MtCLE13 насуперклубенькообразующий фенотип мутанта sym29, несущего мутацию в CLV1подобном гене, согласуются с известными ранее в литературе данными,полученными для мутантов лядвенца и люцерны, несущих мутации в ортологичныхгенах (LjHAR1, MtSUNN, соответственно) (Okamoto et al.

2009, Mortier et al. 2010).Этоподтверждаетналичиесходныхмеханизмовавторегуляцииклубенькообразования у различных видов бобовых растений с участием CLEпептидов.5.4. Изучение взаимодействия гена WOX5 и компонентов системы CLAVATAпри развитии клубеньков у гороха.5.4.1.

Изучение экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков у растенийгороха дикого типа и суперклубенькообразующих мутантов.Следующим этапом работы было исследование механизмов влияния WOX5 наразвитие клубенька и его взаимодействия с компонентами системы CLAVATA(CLV). Для изучения возможного взаимодействия WOX5 с компонентами системыCLV, мы провели анализ экспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующихмутантов с нарушением авторегуляции клубенькообразования – sym29 (мутация вCLV1-подобном гене) и sym28 (мутация в CLV2-подобном гене). Если WOX532является мишенью системы CLV, то нарушение функции CLV-1 и CLV-2рецепторов, являющихся компонентами побеговой системы авторегуляции, должноприводить к изменению уровня экспрессии этого гена у мутантов.5.4.2. Анализ экспрессии PsWOX5 у суперклубенькообразующих мутантовгороха sym29 и sym28Нами был проведен анализ экспрессии гена PsWOX5 у суперклубенькообразующихмутантов sym29 и sym28 на различных сроках после инокуляции с помощьюколичественной ОТ-ПЦР (рисунок 28).

Анализ показал, что у мутантов горохаsym29 и sym28 максимум экспрессии наблюдается раньше, чем у растений дикоготипа Frisson. У мутантов максимум был выявлен на 7-9 дпи, тогда как у растенийFrisson - на 11 дпи. Кроме того, у мутантов не было выявлено столь значительногоснижения экспрессии PsWOX5 к 15 дпи, как у растений дикого типа (рисунок 28).Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи междуизменениями в системе CLAVATA и экспрессией гена WOX5, который может бытьвозможной мишенью этой системы.Рисунок 28.

Количественный анализ экспрессии гена PsWOX5 усуперклубенькообразующих мутантов sym28 и sym29 с помощью ОТ-ПЦР(Osipova et al., 2012). NI – неинокулированные корни гороха.Количественный анализ выявил более высокий уровень экспрессии гена WOX5при клубенькообразовании у суперклубенькообразующих мутантов гороха, посравнению с растениями дикого типа. Одной из причин таких различий может бытьбольшая численность клубеньков на корнях у суперклубенькообразующихмутантов. В связи с этим нам необходимо было выяснить, может ли увеличениеэкспрессии гена WOX5 у суперклубенькообразующих мутантов быть связано сизменением экспрессии этого гена локально, то есть в отдельных клубеньках.

Сэтой целью был проведен анализ локализации экспрессии гена WOX5 усуперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28, несущих мутации вCLV1-подобном и CLV2 генах.5.4.3. Сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 у горохадикого типа и суперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 снарушением системы CLV.Для локального анализа экспрессии гена WOX5 при развитии клубеньков усуперклубенькообразующих мутантов гороха sym29 и sym28 и растений горохадикого типа Frisson, растения трансформировали штаммом A. rhizogenes,содержащим конструкцию pМtWOX5::GUS. После инокуляции трансгенныхрастений штаммом Rlv CIAM1026, изучали локализацию GUS в образовавшихсяпримордиях/клубеньках на различных сроках после инокуляции.У суперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 активность GUS вотдельных клубеньках была значительно более высокой, чем у растений дикого33типа на всех проанализированных стадиях развития клубеньков.

Особеннозаметными эти различия были на 21 дпи (рисунок 29). В то время как у растенийдикого типа активность WOX5 в клетках клубенька к 21 дпи смещалась кпериферии и сохранялась в основном в области окончания проводящих пучков, то умутантов sym29 и sym28 активность WOX5 на очень высоком уровне наблюдаласьво всей внутренней зоне клубенька.Рисунок 29. Локальный анализ экспрессии WOX5 c помощью репортернойконструкции (pMtWOX5::GUS) в клубеньках гороха дикого типа (А) имутантов sym29 (B) и sym28 (C) на 21 дпи (Osipova et al., 2012).Таким образом, сравнительный анализ локализации экспрессии гена WOX5 приразвитии клубенькову растений гороха дикого типа Frisson исуперклубенькообразующих мутантов sym29 и sym28 показал, что у мутантовзначительно увеличен уровень экспрессии WOX5 и область его экспрессии вотдельных клубеньках, по сравнению с растениями дикого типа. Это позволилоподтвердить предложенную нами ранее гипотезу о том, что экспрессия гена WOX5при развитии клубенька регулируется CLV1-подобным и CLV2 генами.

При этомCLV1 и CLV2 регулируют экспрессию гена WOX5 не только системно (усуперклубенькообразующихмутантовобразуетсязначительнобольшеклубеньков), но и локально (у мутантов по CLV1-подобному и CLV2 генамзначительно увеличен уровень экспрессии гена WOX5 в отдельных клубеньках, посравнению с диким типом).Следовательно, регуляторная система WUS/WOX-CLV может контролироватьне только функционирование апикальных меристем побега и корня у растений, но инеобходима для регуляции развития меристемы клубеньков, которая появляется denovo у бобовых растений при симбиозе.

При этом особенностью функционированияэтой системы у бобовых растений является способность CLE-пептидовосуществлять регуляцию дистанционно, поскольку они синтезируются в корневойсистеме, но взаимодействуют с CLV1 и CLV2 рецепторами, локализованными впобеге.ЗАКЛЮЧЕНИЕНа основании анализа экспрессии генов нодулинов PsEnod5 и PsEnod12a усерии мутантов гороха были получены экспериментальные доказательстваактивации разных сигнальных путей при узнавании Nod-факторов.

Среди двухгенов, исследованных нами, ген PsEnod5 регулируется более строгим образом: дляего активации необходимы не только регуляторы «общего сигнального пути»Sym10, Sym19, Sym8 и Sym9, но также Sym35 (NIN), Sym14, Sym16 и Sym34. Дляиндукции экспрессии PsEnod5 необходим функциональный рецептор Sym37,который, по-видимому, активирует целую группу регуляторных генов,определяющих развитие более поздних этапов симбиоза, связанных с инфекцией и34органогенезом клубеньков. Эти данные свидетельствуют в пользу предположения отом, что у гороха рецепция Nod-факторов может контролироваться разнымирецепторами и осуществляется на двух последовательных этапах развитиясимбиоза – на преинфекционной стадии и при развитии инфекционного процесса.Анализ связывающей способности LysM-РПК Sym10 и Sym37,синтезированных в гетерологичной (бактерии E.

coli) и гомологичной (листья N.benthamiana) системах, выявил низкую аффинность к Nod-факторам. Это указывалона существование дополнительных рецепторов с высокой аффинностью к Nodфакторам в составе рецепторных комплексов, контролирующих узнаваниерастениями гороха этих сигнальных молекул.

Возможным кандидатом на рольтакого рецептора может быть охарактеризованная нами новая LysM-РПК К1. Впользу этого свидетельствуют данные молекулярного «докинга» о способностиLysM-РПК К1 связывать Nod-факторы, а также результаты анализа связывающейспособности К1 с лигандом методом поверхностного плазмонного резонанса. Болеетого, мутанты по гену k1 характеризовались нарушением способностиинициировать симбиоз с ризобиями. Способность LysM-РПК К1 формироватькомплекс с белком Sym10 при ко-экспрессии в листьях N. benthamiana, показываетвозможность физического взаимодействия двух белков.

Формирование такогорецепторного комплекса с К1, может являться необходимым для инициацииразвития симбиоза с ризобиями.Нами впервые была охарактеризована рецептор-подобная киназа Lyk9 ипоказано ее участие в ответе растений на действие ХОС с разной степеньюполимеризации у гороха P.

sativum L. Было показано, что у растений с подавленнойэкспрессией PsLyk9 с помощью РНК интерференции в ответ на обработку ХОС (n =5), выделяемых грибами АМ, наблюдалось значительное снижение экспрессиигенов, являющихся маркерами развития симбиоза с грибами АМ (DELLA, NSP1,NSP2, DWARF27). Вместе с тем, анализ растений с подавлением экспрессии генаPsLyk9 показал их повышенную чувствительность к заражению слабопатогеннымштаммом гриба Fusarium culmorum (Wm.G.Sm.) Sacc.