Автореферат (Сигнальная регуляция развития симбиоза гороха Pisum sativum L. с клубеньковыми бактериями), страница 2

В основе авторегуляции лежит сигнальный обменмежду регуляторными компонентами в побеге и корне растения. В общем видесхема сводится к тому, что инокуляция растений ризобиями приводит к выработкеRS сигнала (от англ. root signal) в корне, который поступает в побег ивоспринимается там узнающими системами растений.

Это способствует активациидругого SDI сигнала (shoot derived inhibitor) в побеге, который поступает в корни иингибирует дальнейшую закладку клубеньков. Ранее выполненные исследованияпоказали, что в авторегуляцию у бобовых растений в побеге могут быть вовлеченынесколько рецепторов с лейцин-богатыми повторами во внеклеточных доменах.Среди них CLAVATA1 (CLV1)-подобный, CLAVATA2 (CLV2), а также KLAVIER(KLV) рецепторы, имеющие достаточно высокий процент сходства с CLV1, CLV2 иRECEPTOR-LIKE PROTEIN KINASE 2 (RPK2), работающими в меристеме побега уарабидопсиса (Krusell et al., 2002; Oka-Kira et al., 2005). Мутации в генах clv1, clv2, атакже klv, приводят к суперклубенькообразующему фенотипу.

Сигнальнымимолекулами RS, вырабатываемыми в корне и запускающими системуавторегуляции, могут являться CLE-пептиды (Mortier et al., 2010). Природа сигналаSDI, выделяемая в побеге, остается неизвестной. Кроме того, практическинеизученным является вопрос о том, на какие мишени в корне растения действуетSDI сигнал.

Это определяло необходимость дальнейшего изучения сигнальногообмена при авторегуляции клубенькообразования.Цель и задачи работыОсновной целью работы явилось изучение сигнальной регуляции развитиясимбиоза между горохом P. sativum L. и клубеньковыми бактериями, начиная отактивации рецепторов при связывании сигнальных молекул, до передачи сигналакомпонентами сигнальных путей и медиаторами ответа на уровне тканей и клеток(гормонами и транскрипционными факторами).Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующиезадачи:61. Изучить у гороха потенциальные рецепторы к сигнальным молекуламклубеньковых бактерий Nod-факторам, провести анализ их связывающейспособности с лигандами и исследовать возможность участия в формированииолигомерных комплексов.2.

Провести поиск и изучить у гороха потенциальные рецепторы кхитоолигосахаридам с разной степенью полимеризации, необходимых для развитиясимбиоза и активации защитных систем растения.3. Изучить роль фитогормонов цитокининов и ауксинов в контроле развитиясимбиотических клубеньков у гороха.4. Исследовать роль гомеодомен-содержащих транскрипционных факторовсемейств KNOX и WOX в контроле органогенеза симбиотических клубеньков угороха.5. Изучить особенности сигнального обмена при системном регулировании угороха числа формирующихся клубеньков (при авторегуляции симбиоза).Научная новизна.Впервые выявлены и охарактеризованы новые рецепторы гороха К1 и Lyk9,необходимые для узнавания растением двух типов структурно-сходных сигнальныхмолекул – Nod-факторов и олигомеров хитина.

Установлено, что уникальныйрецептор К1 необходим для инициации симбиоза, что может быть использовано вгенной инженерии. Получены экспериментальные доказательства в пользутеоретической модели двухэтапной рецепции Nod-факторов у гороха. Была решеназадача биосинтетического получения олигомеров хитина со степеньюполимеризации n = 5. Предложенный новый способ получения этих соединенийбыл связан с конструированием штаммов E. coli – суперпродуцентовхитоолигосахаридов. Впервые показано, что при инокуляции ризобиями у растенийгороха активируется биосинтез цитокининов под влиянием компонентовсигнального каскада, активируемого Nod-факторами.

При этом биосинтезцитокининов происходит на нескольких этапах развития симбиоза. Анализмутантов гороха впервые показал, что цитокинины могут влиять как на процессзакладки клубеньков, так и на процессы дифференцировки тканей клубенька.Установлено, что механизмы влияния транскрипционных факторов семействKNOX и WOX на закладку новых органов - симбиотических клубеньков - могутбыть универсальными и сходными с теми, которые вовлечены вконтрольразвития регулярных меристем растений.

Расшифрованы механизмы системногорегулирования у растений гороха процесса формирования симбиотическихклубеньков с участием регуляторного CLE-пептида, системы рецепторовCLAVATA и транскрипционного фактора WOX5.Теоретическое и практическое значение. Полученные данные позволилипредложить новую схему сигнальной регуляции бобово-ризобиального симбиоза,что значительно расширяет представления о взаимоотношениях междусимбионтами и хозяевами, а также особенностях формирования внутриклеточныхструктур, обеспечивающих их взаимодействие.

Разработаны новые способыполучения хитоолигосахаридных сигнальных молекул (патенты РФ на изобретение№ 2460800 и 2517620 от 04.08.2010).Защищаемые положения диссертации:1. Предложена модель, согласно которой узнавание Nod-факторов у гороха7осуществляется отличающимися по специфичности и аффинности комплексамирецепторов,работающими последовательно на разных этапах развитиясимбиоза. Рецептор-подобная киназа К1 является новым рецептором к Nodфакторам, необходимость которой для симбиоза подтверждается Nod-фенотипом мутантов по этому гену.2. Бифункциональный рецептор гороха Lyk9 необходим для узнаваниясигнальных молекул хитоолигосахаридов с разной степенью полимеризации, науровне которого происходит разделение путей, ведущих к развитию симбиозаили активации защитных систем растений.3.

Фитогормоны цитокинины и ауксины вовлечены в передачу сигнала от Nodфакторов и необходимы как для регуляции начальных этапов органогенезаклубеньков, так и более поздних стадий, связанных с дифференцировкой тканейклубенька. Изменения в содержании цитокининов при клубенькообразованиисвязаны с активацией биосинтеза этих гормонов в растении под влиянием Nodфакторов, тогда как в основе изменений в содержании ауксинов лежат процессытранспорта. С выходом бактерий из инфекционных нитей в клетки коры корняможет быть связана дополнительная активация биосинтеза цитокининов, чтовлияет на дифференцировку тканей клубенька.4.

Особенности регуляции экспрессии KNOX3 и WOX5 при клубенькообразованииу гороха подтверждают существование универсальных механизмов контроляпролиферации и дифференцировки клеток с участием генов KNOX и WOX вапикальных меристемах и при развитии меристем специализированных органов– клубеньков бобовых растений.5. Регуляторная система WOX-CLV может контролировать развитие меристемыклубеньков, которая появляется de novo у бобовых растений при симбиозе. Приэтом особенностью функционирования этой системы у бобовых растенийявляется способность CLE-пептидов осуществлять регуляцию дистанционно.Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверностиполученных данных определена статистическим анализом, воспроизводимостьюэкспериментов, сравнением выявленных закономерностей на разных объектах и ихсоответствием современным биологическим концепциям.

Материалы диссертациибыли представлены на 25 научных конференциях, среди которых: 8международный конгресс по молекулярной биологии растений в 2006 (г. Аделаида,Австралия); школа-конференция AB-RMS «Агробиотехнология в корневыхмикробных системах» в рамках программы NOVA University Network в 2008 (г.Тюне, Дания); 9 Европейская конференция по азотфиксации в 2010 (г.

Женева,Швейцария); 17 международный конгресс по азотфиксации в 2011 (г. Перт,Австралия); 10 международная конференция Европейского хитинового общества в2011 (г. Санкт-Петербург); 10 международной конференции «Современныеперспективы в исследовании хитина и хитозана» (РосХит 2010) в 2010 (г. НижнийНовгород), "Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана" (РосХит2012) в 2012 (г. Мурманск), 11 Европейская конференция по азотфиксации в 2014(Канарские острова, Испания); 19 международный конгресс по азотфиксации в2015, (г. Калифорния, США).Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 печатных работ,из них 22 в журналах перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ (в том числе 208статей в журналах, индексированных Thompson Reuters ISI, 4 – в других журналах исборниках, 2 патента и 25 – тезисы и материалы конференций.Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 285 страницах,содержит 76 иллюстраций и 1 таблицу, включает введение, 3 главы, заключение,выводы, список литературы. Библиография включает 340 литературныхисточников, из них 336 - иностранных.ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫВ обзоре литературы проанализированы данные классических и современныхисследований, посвященные изучению сигнального обмена при развитиисимбиотических взаимоотношений у бобовых растений с азотфиксирующимиклубеньковыми бактериями.Методология и методы исследованияРастительный материал и штаммы микроорганизмов. В работе былииспользованы линии гороха (Pisum sativum L.) из генетической коллекции ФГБНУВНИИСХМ: исходная линия Frisson (Duc and Messager, 1989) исуперклубенькообразующие мутантные линии P88 (sym 29) и P64 (sym 28);исходная линия SGE (Kosterin, Rozov, 1993) и мутантные линии SGENod--1 (sym35),SGENod--6 (sym7), SGEFix--1 и SGEFix--6 (sym40), SGEFix--2 и SGEFix--5 (sym33)(Tsyganov et.al., 1998).

Для инокуляции растений гороха использовали штамм Rh.leguminosarum bv.viciae (Rlv) CIAM1026 из коллекции ФГБНУ ВНИИСХМ. Длятрансформации гороха использовали штамм Agrobacterium rhizogenes Arqua1.Количественный ПЦР (qRT-PCR). Суммарная РНК была изолирована изкорней и клубеньков гороха с помощью реактива Trizol. 1 – 2,5 мкг РНК былииспользованы для синтеза кДНК с помощью обратной транскриптазы.Количественный ПЦР был проведен в CFX-96 системе (Bio-Rad Laboratories, США)с использованием SYBR Green красителя. Значения порогового цикла (CT) былиполучены с помощью программы CFX-96 и проанализированы с помощью 2-ΔΔCtметода (Livak and Schmittgen, 2001).