Автореферат (Сигнальная регуляция развития симбиоза гороха Pisum sativum L. с клубеньковыми бактериями)

На правах рукописиДОЛГИХЕлена АнатольевнаСИГНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ СИМБИОЗА ГОРОХАPISUM SATIVUM L. С КЛУБЕНЬКОВЫМИ БАКТЕРИЯМИ03.01.05 Физиология и биохимия растений03.02.03 МикробиологияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степенидоктора биологических наукСанкт-Петербург20162Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной биологииФедерального государственного бюджетного научного учрежденияВсероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственноймикробиологии, г. Санкт-ПетербургКонсультант: доктор биологических наук, профессор, академик Российскойакадемии наук Тихонович Игорь АнатольевичОфициальные оппоненты:Щеголев Сергей Юрьевич, доктор химических наук,профессор, директор Учреждения Российской академии наук Институтабиохимии и физиологии растений и микроорганизмов, зав.

лабораториейиммунохимииТопунов Алексей Федорович, доктор биологических наук,заведующий лабораторией биохимии азотфиксации и метаболизма азотаФедерального государственного учреждения "Федеральныйисследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии»Российской академии наук"Хлесткина Елена Константиновна, доктор биологическихнаук, заведующая сектором функциональной генетики злаков Федеральногогосударственного бюджетного научного учреждения «Федеральныйисследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирскогоотделения Российской академии наук»Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждениенауки институт физиологии растений имени К.А.Тимирязева Российской академии наукЗащита диссертации состоится «___»________2017 г.

в «___» ч на заседаниисовета ДМ.212.232.07 по защите докторских и кандидатских диссертаций приСанкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, Биологическийфакультет, ауд. №.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета, на сайтеhttp://spbu.ru/Факс для отзывов: +7 (812) 470-43-62.Автореферат разослан «__»________2017 г.Ученый секретарьДиссертационного советаЕ. И. Шарова3ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность и степень разработанности темы исследования.Поиск регуляторов роста и развития растений является приоритетной задачейбиологии.

Возникшие в процессе длительной эволюции разнообразныевзаимоотношения микроорганизмов и растений являются уникальным резервом дляпоиска таких регуляторов. Характер взаимоотношения растений с широким кругомпочвенных микроорганизмов во многом определяется их способностью узнаватьповерхностные компоненты клеток и секретируемые сигнальные молекулы,действующие в малых концентрациях и вызывающие каскад ответных реакций. Умикроорганизмов одним из основных классов соединений, способных вызыватьответные реакции растения, является хитин и его производные, состоящие изостатковN-ацетилглюкозамина.

Низкомолекулярные производные хитина(олигомеры хитина, n ≥ 6), выделяемые при расщеплении клеточных стенокфитопатогенных грибов, вызывают у растений развитие комплекса защитныхреакций. Декорированные олигомеры хитина – Nod-факторы и Myc-факторы, атакже короткие олигомеры хитина (n = 4-5), выделяемые бактериями порядкаRhizobiales и грибами арбускулярной микоризы (АМ), вызывают развитиесимбиотических реакций (Spaink et al., 1991; Maillet et al., 2011).

Поскольку даженебольшие изменения в структуре этих молекул вызывают совершенно разныеответы со стороны растения, изучение механизмов, позволяющих растениямразличатьструктурно-сходныесигнальныемолекулыипередаватьиндуцированный связыванием лиганда сигнал далее, к эффекторным системамрастения, затрагивает важные фундаментальные проблемы биологииипредставляет практический интерес.Как показали исследования последних лет, в рецепцию хитоолигосахаридныхсигнальных молекул могут быть вовлечены специализированные рецепторы сLysM-мотивами во внеклеточных доменах (Madsen et al., 2003; Radutoi et al., 2007).Для отдельных рецепторов этого типа, в частности контролирующих активациюзащитных реакций растений на хитин и его производные, были изучены механизмыработы рецептора при связывании лиганда, но только для модельных растений (Liuet al., 2012).

Однако для большинства рецепторов этого типа активационныемеханизмы при связывании лиганда и дальнейшие пути передачи сигнала остаютсямалоизученными.Остается неясным, как у бобовых растений с разным типомклубенькообразованияосуществляетсярецепциясигнальныхмолекулризобиальных Nod-факторов.

Эксперименты по влиянию мутантных штаммовризобий, выделяющих Nod-факторы с измененной структурой, на развитиесимбиогенезаулюцерныигороха(формирующихклубенькинедетерминированного типа), позволили предположить, что узнавание Nodфакторов может осуществляться двумя отличающимися по специфичностирецепторами, работающими на разных этапах развития симбиоза (Ardourel et al.,1994; Walker and Downie, 2001). У гороха были выявлены несколько кандидатов нароль рецепторов к Nod-факторам на основании изучения мутантов, имеющихнарушения в генах sym10 и sym37, кодирующих LysM-рецептор-подобные киназы(LysM-РПК) (Madsen et al., 2003; Limpens et al., 2003; Smit et al., 2007; Zhukov et al.,2008).

При этом нарушение развития симбиоза у таких мутантов наблюдалось какпри инициации этого процесса (sym10), так и на более поздней стадии при развитииинфекции (sym37), что соответствовало гипотезе об участии двух рецепторов в4связывании Nod-факторов. Однако у LysM-РПК Sym10, необходимой дляинициации симбиоза, киназный домен являлся неактивным (Madsen et al., 2003), чтоуказывало на возможность формирования комплекса с дополнительнойрецепторной киназой, которая до настоящего времени еще не выявлена (Geurts etal., 2005). Это определило актуальность изучения биохимической функции ужевыявленных рецепторов и поиска новых, контролирующих узнавание растениемNod-факторов.Для изучения способности растений гороха различать хитоолигосахариды сразной степенью полимеризации, вызывающих развитие симбиоза или стимуляциюиммунных реакций, необходимо было выявить у них специфичные рецепторы кэтим сигнальным молекулам.

Поиск таких рецепторов и изучение особенностейвнутриклеточной передачи сигнала является необходимым этапом для выяснениятого, как растения различают патогенные и симбиотические микроорганизмы. Вкачестве модельной системы для таких исследований удобно использовать бобовыерастения, поскольку они, с одной стороны, формируют два типа симбиозов - сбактериями ризобиями и грибами АМ (то есть обладают рецепторами к Nodфакторам и Myc-факторам, олигомерам хитина n = 4-5), а с другой обладаютэффективными системами рецепции молекул, вызывающих развитие защитныхреакций (олигомерам хитина, n ≥ 6).При бобово-ризобиальном симбиозе Nod-факторы запускают комплексспецифичных ответов в эпидерме, перицикле и коре корня растения, тем самым,обеспечивая основу для последующего проникновения ризобий в клетки растений,развития инфекции и морфогенеза клубеньков. Несмотря на то, что Nod-факторыостаются связанными с клетками эпидермы и не проникают внутрь корня, процессыв эпидерме корня четко скоординированы с изменениями, происходящими вудаленных клетках коры корня – реактивацией делений клеток коры, эндодермы иперицикла и формированием примордия/меристемы клубенька.

Это указывает навовлечение в контроль развития нового органа эндогенных регуляторов самогорастения (прежде всего, фитогормонов). При этом неразрешенным остается вопросо том, как взаимодействуют между собой компоненты сигнального пути,активируемые Nod-факторами и фитогормоны, а также каким образомосуществляется передача сигнала от Nod-фактора в клетки корня с участием этихрегуляторов.

Это определило необходимость изучения роли фитогормонов вконтроле различных этапов клубенькообразования.Клубеньки у бобовых растений формируются в результате реактивацииотдельных клеток корня, их де-дифференцировки и стимуляции деления, чтопредполагает участие в контроле пролиферации и дифференцировки клетокэндогенных регуляторов самого растения (регуляторов клеточного цикла,транскрипционныхфакторов).Механизмытакойрегуляциидляспециализированных органов - азотфиксирующих клубеньков – остаются ещедалекими от понимания, но они могут быть достаточно сходными с теми, которыеконтролируют у растений формирование органов de novo. Это открывает новыеперспективы для изучения органогенеза клубеньков: можно изучать влияниеключевых регуляторов пролиферации и дифференцировки клеток на развитиеклубеньков, участие которых в контроле органогенеза уже исследовано намодельных растениях, например, Arabidopsis.Важную роль в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток играютпредставители двух семейств гомеодомен-содержащих транскрипционных5факторов WOX и KNOX (Haecker et al., 2004).

Представители WOX семейства –транскрипционные факторы WUSСHEL и WOX5 - контролируют развитиеапикальных меристем побега и корня (ПАМ и КАМ). Они отвечают за поддержаниеклеточных делений и подавление дифференцировки прилежащих к покоящемусяцентру стволовых клеток (Sarkar et al., 2007). Гены семейства KNOX необходимыдля поддержания активности ПАМ. Представители KNOX семейства SHOOTMERISTEMLESS (STM) и KNAT1/BP - ключевые регуляторы развитияПАМ у Arabidopsis.

Мутанты A. thaliana с потерей функции этих генов не способныинициировать развитие ПАМ. Таким образом, эти регуляторы важны дляформирования меристемы и для последующего поддержания её организации.Однако роль генов WOX и KNOX в контроле развития примордия/меристемыклубеньков малоизучена.

В связи с этим, необходимо было провести поиск геновWOX и KNOX, которые могут играть существенную роль в органогенезе клубенькови изучить их возможное взаимодействие с гормональной системой ирегуляторными пептидами при развитии клубеньков.Наряду с механизмами локального контроля, в процесс формированияклубеньков у бобовых растений вовлечены и системные механизмы (авторегуляцияклубенькообразования), с помощью которых растение ингибирует дальнейшееформирование клубеньков на корнях после появления первых клубеньков (CaetanoAnolles and Gresshoff, 1991).