Диссертация (Пространственное строение и внутримолекулярная динамика модифицированных аналогов стероидных гормонов на основе данных спектроскопии ЯМР), страница 11

Она заключается в том, что нет никакой необходимости в использовании низкихтемператур, которое обычно применяется, чтобы свести решение такой задачи к наблюдениюизвестных спектральных проявлений замедления скорости процесса вплоть до перехода кусловиям медленного обмена [284, 285]. Такая процедура имеет свои преимущества и оченьнаглядно доказывает присутствие внутримолекулярной динамики. Но вместе с тем припонижении температуры достаточно часто происходит простое “вымораживание” минорного48конформера [286, 287], а также сильное ухудшение спектрального разрешения из-заповышения вязкости растворителя вплоть до его замерзания задолго до обнаружениятемпературы коалесценции.Поскольку наличие быстрого конформационного обмена приводит к уменьшениюнаблюдаемых расстояний, то, учитывая характер влияния анизотропии диффузии приразличных ориентациях эталонного расстояния rэт.

относительно главной оси стероидноймолекулы, можно утверждать, что выбор rэт. с ориентацией его радиус-вектора вдоль главнойоси, является более предпочтительным с точки зрения обнаружения признаков динамическихпроцессов в виде занижения значений некоторых из измеряемых расстояний.

При этом нетнеобходимости введения поправки на анизотропию диффузии, поскольку все отклонения засчет анизотропного эффекта будут происходить в сторону увеличения ЯМР-расстояний.Поэтому отклонения в сторону их уменьшения за счет внутримолекулярной динамики будутнаблюдаться в этом случае значительно легче, чем при любом другом выборе эталонной парыпротонов.Хотя углеродный скелет стероидных молекул с природным сочленением колец является,как правило, достаточно “жестким”, для их изоаналогов с цис-сочленением колец В/С и/илиС/D, а также при введение заместителей в различные положения колец A, В, С и D неисключеныдинамическиепревращения,связанныесизменениемконформациициклогексановых колец. Такие процессы хорошо известны и достаточно изучены намодельных соединениях [288, 289].

Как правило, инверсия шестичленных цикловхарактеризуется барьерами 6 – 12 ккал/моль [290] и при комнатной температуре такойконформационный обмен является быстрым в шкале времени ЯМР. Динамические процессыпсевдовращения шестичленных и других циклов часто обнаруживается при изученииполициклических насыщенных соединений малого и среднего размера [291‒296].В случае биологически активных стероидных гормонов интерес к таким превращениямсвязан с возможностью влияния внутримолекулярных динамических процессов на их свойствапри использовании в качестве лекарственных препаратов. Из описанных в литературеконформационных превращений в стероидах наиболее известными являются работы поизучению динамических процессов в шестичленном кольце А [297‒300], а также впятичленном кольце D [301, 302]. На рисунке 1-13 в качестве примера показандвухпозиционный конформационный обмен АВ в стероиде (VIII), который заключаетсяв быстром переходе между нормальной 1α,2β конформацией “полукресло” (А) иинвертированной 1β,2α конформацией “полукресло” (В).49Рис.

1-13. Изменениепространственного строениякольца А при двухпозиционномобмене в стероиде (VIII).Существует также несколько примеров существования таких молекул либо в раствореили в твердой фазе в конформации (В). Основным инструментом экспериментальногодоказательства конформации кольца А, служили вицинальные константы 3J1α-2α и 3J1β-2α.. Иханомальные значения были обнаружены в протонном спектре 2β,17β-диацетоксиэстр-4-ен-3она [303].

Они были интерпретированы как свидетельство существования данного стероида врастворе в промежуточной конформации “софа”, хотя с не меньшим основанием эта жеинформация может быть интерпретирована как усредненное значение между величинамиконстант в нормальной (А) и инвертированной (В) формах. Интересная ситуация былаобнаружена в работе [304] для нескольких 19-нор-4,9-диен-3-онов, которые в твердой фазеимели инвертированную конформацию (В) кольца А, а в растворе эти стероиды существовалив виде конформационного равновесия между инвертированной и нормальной формами. Спомощью РСА было получено объяснение этого экспериментального факта. Оказалось, что в19-нор-тестостероне кольцо А обладает большей конформационной свободой, по сравнению стестостероном [305, 306].

Самым удивительным в этих исследованиях было обнаружениевлияния на положение конформационного равновесия заместителей, максимально удаленныхот кольца А. Например, было обнаружено различие в положении равновесия междупрогестероном и 17α-ацетокси-прогестероном [307]. Это было воспринято авторами какобъяснение известных различий биологической активности этих стероидов [308], а в работе[309] с помощью квантово-механических расчетов сделана попытка теоретическогообоснованиятакойгипотезы.Новболеепозднихисследованияхконформационного равновесия в кольце А с помощью спектроскопии ЯМРпроблемы1Н [297]сравнивались величины всех 6-ти геминальных и вицинальных скалярных констант вэтановом фрагменте С1Н2-С2Н2 для десяти 4-ен-3-он стероидов при двух различающихся на 50ºС температурах. Авторам этой работы удалось обеспечить очень высокую точность50измерения указанных констант2,3JН-Н в пределах ±(0.02-0.06) Гц и они надеялисьзарегистрировать смещение равновесия по величине и характеру их изменения.

Средиобъектов этого исследования были прогестерон и 17α-ацетоксипрогестерон. Однако, прииспользовании данного подхода для этих соединений не было зарегистрировано каких-либоразличий ни в величинах изменения констант2,3JН-Н, ни в их характере. Это означает, что вранних публикациях была допущена какая-то экспериментальная или логическая ошибка,которая привела к неверному заключению о разных предпочтительных конформациях дляпрогестерона и 17α-ацетоксипрогестерона.

Рассмотренный пример свидетельствует не толькоо преимуществах спектроскопии ЯМР по изучению динамических процессов по сравнению сданными РСА, на которых основывалась ранняя версия о существенном влиянии заместителейв кольце D на конформационное равновесие в кольце А. Он также показывает возможностьпрямого доказательства с помощью ЯМР, что это не так и произошла ошибка, а главнымаргументом является точность измерения констант и очень критичный подход авторов работы[297] к своим собственным результатам. Рассматриваются все без исключения возможныеверсии объяснения изменения констант с температурой, включая изменение химическихсдвигов не только тех протонов, между которыми наблюдаются скалярные взаимодействия, нои изменение положений в спектре сигналов других протонов, которые входят в состав этихспиновых систем.При условии сильносвязанности расстояние между отдельнымикомпонентами мультиплетного сигнала могут изменяться так же, как и за счет смещенияконформационногоравновесия.Вкладэффектовсильносвязанностивнаблюдаемыеизменения констант может быть учтен с помощью процедуры симуляции спектров, чтоавторы делают с присущим импрофессионализмом.

Через 6 лет другая группа авторовиспользовала такую же методологию обнаружения и описания конформационной динамикиколец А и В в стероидных 4-ен-3-онах при введении атомов брома в положения 2, 4 и 6 [299].Лишь увеличение температурного диапазона до 80 ºС отличает методологию этой работы отизложенного выше подхода. Но одновременно с этим была сделана попытка использованияЯЭО для подтверждения конформационного равновесия в кольце А. Авторы подчеркивают ееисключительно качественный характер.

Они наблюдали в стационарном режиме насыщенияпротонов метильной группы С19Н3 1α,6β-дибромзамещенного стероида положительный ЯЭОна сигналах протонов 1β и 2β.Превышение наблюдаемого усиления на первом из этихпротонов по сравнению со вторым авторы интерпретировали как результат существованияконформационного равновесия в этом стероиде между нормальным и инвертированнымконформерами.

Про этот эксперимент написано всего два предложения, но следует признать,что это была первая осознанная попытка использования ЯЭО для регистрации быстрого51конформационного равновесия в стероидах. Хотя эта попытка была проведена накачественном уровне и в стационарном режиме, а от ее результатов ничего не зависело, всеравно она была (насколько известно) и останется первой. Более того, ее результаты непротиворечатдругимболеевесомымаргументамсуществованиядинамическогоконформационного равновесия в стероидном кольце А.Конформационный анализ 13α-стероидов с помощью спектроскопии ЯМР, РСА иметодов молекулярного моделирования привел авторов работы [301] к довольно интересномувыводу об изменении пространственного строения кольца С при введении заместителя вположение 17β от нормальной конформации “кресло” до конформации “твист-ванна”.

Приэтом конформация пятичленного кольца D оказывалась максимально динамичной: расчетыуказывают на возможность реализации в растворе динамического равновесия по крайней меремежду конформациями 14β-“конверт” , 13α,14β-“полукресло” и 13α-“конверт”. Следуетотметить, что основным источником информации для сделанных выводов служили результатырасчетных методов и данные РСА. Спектроскопия ЯМР использовалась как рутинныйинструмент для спектрального описания объектов исследования.

Вместе с тем, приобсуждении результатов авторы перечисляют потенциальные возможности спектроскопииNOESY для спектрального разделения нормальной конформации кольца С – “кресло”иинвертированной – “твист-ванна”: в первом случае ароматический протон 1 можетвзаимодействовать только с протоном 11α, а во втором – с двумя геминальными протонами11α и 11β, причем примерно с одинаковой интенсивностью. Несмотря на качественныйхарактер этих рекомендаций, в них заключается указание на достаточно простой путь решениязадачи об идентификации двух альтернативных конформаций.

Работа [301] вышла в 2000 годуи отражаеттипичный характер использования ЯЭО для анализа внутримолекулярнойдинамики стероидов на тот период.Аналогичный подход по использованию ЯЭО был представлен в работах [310‒312] поизучению динамики кольца А в 3α-гидрокси-2β-замещенных аминостероидах – выбор междуконформациями в растворе стероидной молекулы с морфолиновым заместителем в положении2 определялся на основании расчетных значений расстояний между протонами кольца Астероида и ближайшими аксиальными или экваториальными протонами морфолиновогокольца.

Наряду с использованием ЯЭО в этих работах активно применялись измерениявицинанальных констант 3J1α-2α, 3J1β-2α и 3J2α-3β. Например, на основании измерения последнейиз них в условиях быстрого в шкале времени ЯМР обмена была сделана количественнаяоценка соотношения конформеров, имеющих нормальную (“кресло”) и инвертированную(“твист-ванна”) конформацию кольца А, в двух разных растворителях – в хлороформе и в52диметилсульфоксиде.