Диссертация (Пространственное строение и внутримолекулярная динамика модифицированных аналогов стероидных гормонов на основе данных спектроскопии ЯМР), страница 7

Поэтому самым логичным вариантом проверкивозможностей новой методологии количественных измерений межпротонных расстоянийбыло самостоятельно пройти весь путь от начала до конца на примере изучения одного изстероидов. Этот путь включал регистрацию серии спектров NOESY при разных временахсмешивания τm в режиме с неполным релаксационным восстановлением (Fast NOESY), выборвэтомспектреподходящихдляколичественногоинтегрированиякросс-пиковисоответствующих им диагональные пиков, максимально полное и одинаковое устранениефазовых искажений по координатам F2 и F1 во всех зарегистрированных фазочувствительныхспектрах NOESY, а также подстройку базовой плоскости.

Затем следовало максимально точноизмерить объемные интегралы каждого из кросс- и диагональных пиков, оценивая при этомэкспериментальную погрешность интегрирования, построить графические зависимости /11/или /12/ и получить значения скоростей кросс-релаксации, которые необходимы длявычисления межпротонных расстояний калибровочным методом.Иначе говоря, необходимо было продумать, а затем шаг за шагом проделать всю туэкспериментальную, расчетную и аналитическую работу, которая входит впонятиепостроение методологии количественных оценок межпротонных расстояний в малыхполициклических молекулах. Поэтому в той части настоящего исследования, которая связанас построением и развитием методологии, стероидные молекулы выполняют роль достаточносложных модельныхсоединений, на примере которых будут представлены вседополнительные возможности спектроскопии ЯМР, в том числе связанные с количественнымиоценками межпротонных расстояний.

Эта работа велась достаточно долго, поэтому различныесоставляющиеметодологиипоявлялисьииспытывалисьнапримереизученияпространственного строения и внутримолекулярной динамики самых разных стероидныхгормонов. Поэтому по причине известной спектральной сложности объектов исследования31изложение материала диссертации дается не в хронологическом порядке, а в порядкевозрастаниясложностиихспектральногопредставления.Приэтомотдельныеметодологические находки и решения конкретных проблем неизбежно оказываютсяразбросанными по тексту диссертации. Чтобы компенсировать этот очевидный недостаток,основные особенности методологии данной работы кратко изложены на несколькихследующих страницах.1.4.Основные направления развития методологии исследованияПрежде всего, следует отметить, что при исследовании стероидов с помощьюспектроскопии ЯМР в настоящей работе активно использовались многие известныеметодологические разработки, которые давно себя хорошо зарекомендовали.

Практически всеони были рассмотрены в первых разделах данной главы. Это относится, конечно, киспользованию в конформационном анализе не только вицинальных констант 3JH-H, но идальних констант 4-6JH-H [200, 201].В некоторых случаях весьма информативными оказывались константы междугеминальными протонами 2JH-H. Следует лишь подчеркнуть, что весьма перспективнымоказался переход от сравнения абсолютных значений экспериментальных и расчетныхконстант к сопоставлению их относительных изменений при переходе между близкими построению стероидами. В этом случае удается избавиться от систематических вкладов впогрешностьрасчетныхданныхизафиксироватьдаженебольшиеразличиявпространственном строении сравниваемых молекул.

К этому следует добавить, что отнесениясигналов в спектре ЯМР 1Н исследованных стероидов проводилось с использованием теперьуже почти стандартного набора корреляционных методов. Тем не менее, эта процедура понастоящее время даже на частоте 600 МГц остается за пределами рутинного примененияспектроскопии ЯМР. Это же можно сказать и об анализе мультиплетных структур протонныхсигналов [202‒211], входящих в состав самых разных по сложности спиновых систем.Поэтому к такому анализу в рамках данной работы привлекались самые различные способыупрощения спектров [212‒216], начиная от применения симуляции отдельных его фрагментовдо разложения перекрывающихся областей спектра ЯМР 1Н по одноквантовым частотамуглеродных сигналов с помощью спектроскопии HSQC [217‒220].Немаловажным обстоятельством данной работы является также то, что она практическиполностью выполнена на спектрометре с относительно невысокой рабочей частотой 300 МГц.Это конечно создавало дополнительные сложности при идентификации сигналов в спектрахЯМР 1Н стероидных молекул.

Но одновременно приводило к появлению преимуществ приизучении кросс-релаксационных процессов (ЯЭО) по сравнению с более высокочастотными32приборами. Это преимущество заключалось в обеспечении при комнатной температуре почтиидеального соотношения между скоростью диффузии и частотой Ларморовой прецессии,которое приводило к доминированию диполь-дипольного механизма релаксации [221] и,следовательно, к максимальным значениям ЯЭО на линейном участке его зависимости отпараметра ωоτс в области выполнения условия экстремального сужения линий. Указанныеобстоятельства в свою очередь во многом определяли методологию всего исследования:основные усилия были сосредоточены на максимально эффективном использовании кроссрелаксационных измерений, включая корректную оценку межпротонных расстояний иобнаружение конформационных превращений стероидных молекул.

Такое использованиепреимуществ относительно низкой частоты спектрометра не отменяло решения других задач,таких как идентификация сигналов, определение схем скалярного связывания и измерениеконстант этих взаимодействий с целью использования их в структурном и конформационноманализе [222].Но пытаться реально конкурировать в экспериментальном отношении с возможностямивысокочастотных приборов вряд ли было целесообразно. В идеальной ситуации длявыполнения работы по ЯМР-изучению стероидов должно быть использовано 2 спектрометра:один на 500-600 МГц для решения проблем спектрального анализа, второй на 300-400 МГц –для релаксационных измерений, включая ЯЭО.Таким образом, при выборе пути создания методологии исследования наряду с учетомхарактерных особенностей спектральных и релаксационных характеристик потенциальныхобъектов исследования (например, сложных насыщенных полициклических соединений)должны учитываться экспериментальные возможности доступного оборудования в периодпроведения такой работы.

Поэтому уместно хотя бы перечислить основные особенностиспектральных и релаксационных характеристик стероидных гормонов, на примере которыхпроводилась апробация возможностей предлагаемого подхода.Спектральные особенности стероидных молекул:- перекрывание около 20-ти сигналов в алифатической области спектра ЯМР 1Н,-наличиебольшогочислакосвенныхспин-спиновыхвзаимодействиймеждуалифатическими протонами, многие из которых входят в состав сильносвязанных спиновыхсистем,- ширина мультиплетных сигналов может достигать 50 Гц.- наличие дальних скалярных взаимодействий через 4 и даже 6 связей.Релаксационные характеристики стероидов:33-время корреляции общего диффузионного движения τс в невязких растворителях(СDСl3) составляет около 10-11 с и на частоте 300 МГц величина параметра ωоτс равна 0.02,следовательно, доминирует диполь-дипольный механизм релаксации, который обеспечивает:a) высокие скорости спин-решеточной релаксации ядер 1Н и протонированных ядер 13С:ρ1 ~ (1 – 3) c-1,б) высокие скорости кросс-релаксации:σij ~ τс /rij6,- для стероидов характерна также высокая анизотропия диффузионного движения:D║ /D┴ = (5 – 14).Теперь вернемся к первым публикациям по количественной оценке межпротонныхрасстояний и попробуем ответить на один очень важный вопрос, какие факторы моглиопределить заниженные значения ЯМР-данных для стероидов (III) и (IV), которые былипоказаны на рисунке 1-4.

Среди них можно выделить, по крайней мере, три потенциальныевозможности ‒ наблюдаемые заниженные значения некоторых расстояний связаны:a) – с внешней релаксацией, которая обычно называется спиновой диффузией (илиэффектом 3-го спина),б) – c анизотропией диффузионного движения стероидных молекул,в) – со скалярной релаксацией 1-рода.Первый вариант объяснения предполагает, что заниженные значения расстояний связаныс отсутствием изолированности спиновой пары, внутри которой происходит динамическоеперераспределениенаселенностейуровней,соответствующеепроцессупереносанамагниченности между магнитными ядрами, который известен под названием ЯЭО.Спиновая диффузия достаточно хорошо изучена и хорошо известны способы ееподавления [188, 223‒233].

Для уменьшения вклада процессов спиновой диффузии следуетстараться использовать короткие времена смешивания, при которых внешняя утечка неуспевает себя проявить. Это означает, что регистрацию ЯЭО нужно проводить в условияхприближения изолированной спиновой пары (ISPA – Isolated Spin Pair Approximation) или вприближении начальных скоростей кросс-релаксации (IRA – Initial Rate Approximation).Спиновая диффузия играет большую роль при изучении макромолекул, поскольку втаких молекулах внешняя утечка через 3-й спин происходит значительно быстрее, чем вмалых молекулах. Более того, спиновая диффузия для малых молекул в принципе не можетувеличить интенсивность кросс-пика, поскольку знак вторичного ЯЭО оказываетсяпротивоположным по отношению к положительному знаку первичного ЯЭО, которыйсоответствует усилению кросс-пика. В работе [228] предложена достаточно простая34процедура оценки влияния 3-го спина на кросс-релаксацию.

Она позволяет оценитьпогрешность в измеряемое расстояние между облучаемым спином “I” (Irradiated spin) инаблюдаемым спином “O” (Observed spin) в зависимости от положения 3-го спина поотношению к двум первым, который определяет внешнюю релаксацию для пары “I” ‒ “O”.Поскольку скалярная релаксация 1-го рода может возникнуть только в молекулах свнутримолекулярной динамикой, а стероиды (III) и (IV) являются жесткими, то объяснениезаниженных расстояний может быть связано со спиновой диффузией (а) и/или анизотропиейобщего диффузионного движения (б).