Диссертация (1145465), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Два указанных обстоятельства заставили будущего Нобелевского лауреата(R.R.Ernst – 1991 г. [1]) в одной из первых работ по теоретическому описанию спектроскопииNOESY [108] предсказать для малых молекул в условиях экстремального сужения линийтолькокачественноеколичественныхиспользованиеоценокЯЭО.межпротонныхНоосновноерасстоянийдляобъяснениевозможностибиоорганическихмолекулзаключается в наличии теоретической базы, основанной на так называемой свободной модели(Free-Model Approach), предложенной в 1982 г. для одновременного описания зависимостискорости кросс-релаксации от межпротонных расстояний и внутримолекулярной динамики[109‒112].22Эта теория не может быть применена для аналогичного изучения малых молекул,находящихся в условиях экстремального сужения линий (ωоτс << 1), поскольку при еесоздании авторами было сделано одно важное ограничение на соотношение между скоростьюдиффузии и скоростью внутримолекулярной подвижности: общее диффузионное движениемолекул, характеризуемое временем τм, находится в условиях предела спиновой диффузии:ωоτм >> 1, а внутримолекулярная подвижность, характеризуемая скоростью τс-1, котораяпревышает скорость диффузии τм-1, находится в условиях экстремального сужения линий:ωоτс << 1.
Это соотношение скоростей представлено на рисунке 1-2, на котором показанафункция спектральной плотности J(ω), описывающая оба вида движения /5/, где S – параметрпорядка: 1 ≥ S ≥ 0, τ – эффективное время корреляции: τ -1 = τм-1 + τс-1. Рис. 1-2.Зависимость вероятностей одноквантовых ‒ W1, двухквантовых ‒ W2 инульквантовых ‒ Wo переходов в двухспиновой системе от параметра ωоτ и соотношениемежду общим диффузионным и внутримолекулярным движениями для свободной моделиЛипари и Сабо [109].Для реализации этого подхода необходимо получить как можно большее числоэкспериментальных данных без особых требований к точности измерения.
В этом случае,кросс-пики в NOESY или ROESY спектрах разделяются по интенсивности, как правило, на 3группы: сильные (расстояния до 3.0 Å), средние (расстояния от 3.0 до 5.0 Å) и слабые(расстояния более 5.0 Å), и в таком виде вводятся в программу обработки данных. Такимобразом, при использовании свободной модели расчёта неточности в оценках исходныхрасстояний компенсируются очень большим массивом этих данных.
Обеспечить такойбольшой объем исходной информации для сравнительно небольших стероидных молекулневозможно. Обычное число объемных интегралов, которые удается получить для однойстероидной молекулы, как правило, не превышает 20-ти. Следовательно, разделение на 323группы, как это делается для больших биоорганических молекул, также невозможно,поскольку наблюдаемые кросс-пики соответствуют расстояниям до 3.0 – 3.5 Å, т.е.соответствуют только сильным взаимодействиям.
Тем не менее, в последнее время появилосьнесколько работ, в которых методология анализа релаксационных данных, основанная насвободной модели Липари и Сабо (Lipari, Szabo) и предназначенная для вполне определенногослучая, распространена на малые молекулы, такие как стероиды, для которых общеедиффузионное движение находится в области экстремального сужения линий: ωоτм << 1.Поэтому результаты такого расширительного подхода вызывают сомнения и требуютнезависимого подтверждения или их опровержения.
В качестве характерного примера можнопривести работу [113], в которой на основании данных по измерению ЯЭО и расчетоввозможных конформаций, соответствующих этим данным на основе свободной модели,делается вывод о существовании 17β-эстрадиола (I) в растворе в виде конформационногоравновесия, связанного с изменением конформации кольца С ‒ переход из конформации“кресло” в доминирующем конформере (А) в конформацию “ванна” в минорном конформере(В).
В данной статье ни одного слова не сказано о правомерности использования такогоподхода и отсутствует какой-либо анализ соотношения скоростей внутримолекулярнойподвижности и общего диффузионного движения. Иными словами, складывается впечатление,чтоуавторовданнойработыоказаласьпрограммаобработкиданныхбольшихбиоорганических молекул и они воспользовались ею для исследования 17β-эстрадиола (I) безпредварительного ознакомления с общими принципами ее работы и границами применимости.В этой связи следует привести название статьи [109], в которой изложены эти принципы играницы применимости теории: – “Model-Free Approach to the Interpretation of NuclearMagnetic Resonance Relaxation in Macromolecules. 1. Theory and Range of Validity”.Аналогичные претензии можно высказать и авторам нескольких других работ [114‒117],в которых методология, разработанная для одного круга объектов, обладающих вполнеопределенным набором спектральных и релаксационных характеристик, переносится надругие молекулы, находящиеся в совершенно (или частично) иных условиях и обладающих,соответственно, иным набором спектральных и релаксационных параметров.
Поэтомурезультаты таких работ требуют независимой проверки.Например, в случае конформационного равновесия 17β-эстрадиола (I) присутствие 17%минорного конформера (В), могло бы быть подтверждено авторами с помощьютемпературных изменений вицинальных констант между протонами кольца С или с помощьюточного измерения только двух межпротонных расстояний: r1-11α и r1-11β. Расчетные значенияэтих расстояний, полученные методом молекулярной механики ММ+, даны на рисунке 1-3.24Рис.
1-3. Конформационныйобмен в 17β-эстрадиоле (I) поданным работы [113] .Двойными стрелками показанырасчетные (ММ+) расстояния отароматического протона 1 доближайших к нему протонов 9α,11α и 11β в каждом из конформеров (I-A) и (I-B).Учитывая нелинейную зависимость эффективных расстояний < r > от населенностиминорного конформера РВ (РА + РВ = 1):<r> =,/6/ можно предсказать, что наблюдаемое отношение интегральных интенсивностей <S1-11α> / <S111β>11αдолжно быть значительно (в 3.7 раза) меньше, чем его величина для конформера (А): S1-(A)/ S1-11β(A) = ( r1-11β(A) /r1-11α(A))6 = (2.83/1.82)6 = (1.55)6 ≈ 14.
Если в растворе, как утверждаютавторы работы [113], присутствует 17% конформера (В), в котором соотношениерассматриваемых расстояний меняется на противоположное, то с помощью формулы /6/можно сделать оценку эффективных расстояний <r1-11α> и <r1-11β>, которыеоказываютсяравными 2.0 и 2.5 Å, соответственно. Следовательно, соотношение интегральныхинтенсивностей, соответствующих этим эффективным расстояниям, должно составлять: <S111α>/ <S1-11β > = ( <r1-11β> / < r1-11α >)6 = (2.5/2.0)6 = (1.25)6 ≈ 3.8 . Таким образом, подтвердитьили опровергнуть существование конформационного равновесия в 17β-эстрадиоле (I) можнона основании измерения и сопоставления между собой интегральных интенсивностей толькодвух кросс-пиков 1/11α и 1/11β.
Следовательно, необходимо проанализировать основныеэкспериментальные и методические факторы, способные повлиять на точность измерениярасстояний,определитьпотенциальныевозможностиихустраненияикритериидостоверности полученных данных. Из этого следует, что необходимы количественныеданныедругихэкспериментальных(РСА)илирасчетныхметодовмолекулярногомоделирования (ММ), которые могли бы быть сопоставлены с результатами ЯМР в видекорреляционных зависимостей. Поэтому нужно максимально увеличивать число измеряемыхрасстояний для каждого из объектов, но при этом стараться не включать в базу ЯМР-данныхте из них, которые по каким-либо причинам не могут быть измерены точно.25Основные экспериментальные и методические факторы, определяющие корректностьиспользования данных по измерению ЯЭО были исследованы в середине 80-годов на примереизучения макромолекул.
Многие выводы, а также средства борьбы с различными видамипобочных эффектов в спектрах NOESY оказались аналогичными и для случая малых молекул.Это, в частности, относится к известной проблеме устранения вклада нуль-квантовойкогерентности (ZQC – zero-quantum coherence) в кросс-пики между скалярносвязаннымипротонами [118‒129] или к проблеме точного измерения интегральных интенсивностей кросспиков [130‒136 ] и корректного определения межпротонных расстояний [137‒142].После многочисленных экспериментов и обсуждений проблемы нульквантового вклада вкросс-пики между скалярно-связанными протонами было сделано оптимистичное заключение,что его величина в большинстве случаев не превышает 3 – 5% от общей интегральнойинтенсивности. При этом важную роль играет качество фазовой коррекции по координатам F2и F1 двумерного спектра NOESY, поскольку сигнал нульквантовой когерентности имеетпротивофазную структуру и при качественной фазировке его интегральная интенсивностьдолжна стремиться к нулю.
Одновременно были разработаны несколько способов подавленияэтого вклада. Наиболее простой из них заключается в случайном варьировании длительностивремени смешивания τm в пределах нескольких процентов от заданной величины, котораясоответствует периоду разностной частоты для двух взаимодействующих протонов. При этомначальная амплитуда нульквантовой когерентности будет в каждом из накоплений меняться впределах указанного периода и, следовательно, суммарный эффект нульквантового вкладабудет уменьшаться с числом повторений эксперимента [143, 144]. Диапазон предложенных способов получения информации о скоростях кросс-релаксациии определения значений межпротонных расстояний крайне широк: от регистрации толькоодного спектра NOESY при конкретном времени смешивания [145‒152] до кинетическихизмерений с помощью варьирования τm в широких пределах.
Появление одномерного методаNOE-difference [153] и двумерной спектроскопии NOESY с фиксированным временемсмешивания τm стимулировало развитие теории нестационарного ЯЭО [154‒171]. В результатеэтих работ существенно расширились возможности спектроскопии ЯМР по изучению какмедленных, так и быстрых динамических процессов в шкале времени этого метода [172] . Дляизучения первых из них незаменимым методом стала обменная спектроскопия EXSY(EXchange SpectroscopY) [173‒177] , которая часто называется EXSY-NOESY, посколькутаких спектрах в виде кросс-пиков регистрируются не только переходы магнитных ядер врезультате химического обмена между двумя (или несколькими) состояниями с разнымхимическим окружением, но и прямые диполь-дипольные взаимодействия (ЯЭО).26Информация о быстрых в шкале времени ЯМР динамических процессах может бытьполучена с помощью измерения релаксационных характеристик, включая скорость кроссрелаксации [178‒185].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
