Диссертация (1145465), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Поскольку релаксационные измерения на ядрах13Свесьма трудоемки, то с целью решения задачи по экспериментальному определению величиныD║/D┴ в настоящей работе был использован другой подход, основанный на измерении исопоставлениигетероядерных эффектов Оверхаузера от двух геминальных протонов ксоседнему атому углерода в метиленовой группе, находящейся в одном из насыщенных колецжесткой стероидной молекулы. Необходимым условием проведения такого измеренияявляется химическая неэквивалентность выбранной пары геминальных протонов, а наиболееподходящим методом регистрации является гетероядерная двумерная спектроскопия 1H-13CHOESY [260‒269].
Для проверки возможности использования данного подхода была выбрана40стероидная молекула (VI)5, в которой метиленовая группа С17Н2 расположена относительноглавных осей молекулы так, что радиус-вектор связи С17–Нβ направлен практическиортогонально главной оси “с”, а радиус-вектор связи С17–Нα оказывается направленным вдольэтой оси (см. рисунок 1-9).Рис.
1-9. Использование гетероядерного эффекта Оверхаузера для определения параметраанизотропии диффузионного движения стероида (VI). Слева показан фрагмент спектраHOESY при τm = 1.2 c, на котором цифрами указаны относительные интегральныеинтенсивности кросс-пиков между ядрами 1Н и 13С в метиленовых группах С6Н2 и С17Н2.Поскольку межъядерные расстояния rС17–Нβ и rС17–Нα можно считать одинаковыми (1.09Å), то соотношение интегральных интенсивностей кросс-пиков Нβ/С17 и Нα/С17, котороесоставляет 2.9 : 1.0, должно отражать только эффект анизотропии диффузионного движения.Следовательно, с помощью представленных на рисунке 1-8 графиков можно сделать оценкупараметра анизотропии, который для перечисленных условий (βС17–Нβ ≈ 90º, βС17–Нα ≈ 0º)оказывается равным примерно 12.
Поскольку погрешность интегрирования кросс-пиков вспектре НОЕSY составляет около ±0.2, то экспериментальный параметр анизотропии длястероидной молекулы (VI) составляет 12±2. При этом его расчетное значение, также как и врассмотренных выше литературных данных, оказывается почти в 2.5 раза меньше: (D║/D┴)расч.= 5.0. К этому следует добавить, что для другой гетероядерной пары радиус-векторов С6–Нβ иС6–Нα, которые оказались в стероиде (VI) ориентированными по отношению к главной оси “c”под примерно одинаковыми полярными углами, отсутствует какое-либо заметное различиемежду интегральными интенсивностями кросс-пиков Нβ/С6 и Нα/С6, которые, соответственно, 5Спектры ЯМР стероида (VI) рассматриваются в главе 2 (раздел 5), где он обозначен как (11в).
В главе 1, гдеиспользуется отдельная нумерация римскими цифрами, этот стероид рассматривается лишь в качествеодного из примеров при обсуждении конкретного вопроса и имеет порядковый номер “VI”.41равны 1.24 и 1.26.Таким образом, результаты использования гетероядерного эффекта Оверхаузера дляопределения параметра анизотропии в стероидных молекулах на качественном и наколичественном уровне совпадают с литературными данными по оценке величины D║/D┴ спомощьюизмерениявремениспин-решеточнойрелаксациинаядрах13С.Этотэкспериментальный параметр значительно (почти в 2.5 раза) превышает его расчетныезначения и составляет для стероидных молекул 12±2.
Следовательно, в случае использованиякалибровочного метода и изотропной модели диффузионного движения, это может приводитьв зависимости от выбора эталонного расстояния к занижению или к завышению измеряемых спомощью ЯЭО межпротонных расстояний до 19.5% от их действительной величины сточностью около ±1.5%. Поэтому расчетная поправка на анизотропию диффузии на основеформул Восснера для жестких аксиально-симметричных молекул должна обеспечиватьуровень точности ЯМР-расстояний в пределах ±5%. Объяснение выхода отдельныхэкспериментальных точек за эти пределы существованием внутримолекулярной подвижностиможет быть дано только после введения поправки на анизотропию диффузии.Другим важным следствием внутримолекулярной динамики является скалярнаярелаксация первого рода, которую для условий быстрого в шкале времени ЯМР химическогообмена на теоретическом уровне рассмотрел в 1961 году А.
Абрагам [12, с. 286–289]. Еговывод о том, что при одновременном существовании между магнитными ядрами дипольдипольного и скалярного механизмов релаксации не следует пренебрегать вторым из нихлишь на основании значительно меньшей величины скалярной константы по сравнению созначением прямой диполь-дипольной константы взаимодействия через пространство. Вусловиях быстрого химического обмена, при котором скалярная константа становитсязависящей случайным образом от времени корреляции обменного процесса τе и это времяоказываетсязначительнобольшевременикорреляцииτсвращательнойдиффузии,определяющего эффективность диполь-дипольной релаксации, вклад скалярной релаксациипервого рода может стать соизмеримым с диполь-дипольной релаксацией или даже превзойтиее.
Это теоретическое заключение А. Абрагама имеет непосредственное отношение к теменастоящего исследования, поскольку ЯЭО и спектроскопия NOESY обусловлены прямымидиполь-дипольнымивзаимодействиямииявляютсякрайневажнымиисточникамиинформации о пространственном строении молекул в растворе.
Таким образом, при быстрыхв шкале времени ЯМР конформационных превращениях (А)(В), для которых скоростьхимического обмена τе-1 превышает разность ларморовых частот 2π(νо(А) - νо(В)), нооказывается значительно меньше скорости вращательной диффузии τc-1, наблюдается42обменное усреднение всех спектральных и релаксационных характеристик изучаемыхмолекул, включая ЯЭО и скалярные константы JН-Н, и может реализоваться ситуациядоминирования скалярного вклада в скорость кросс-релаксации над диполь-дипольнымвкладом. В результате этого в условиях экстремального сужения линий (ωоτс << 1)соответствующего положительного ЯЭО, наблюдаемые (т.е. эффективные) положительныезначения ЯЭО могут оказаться ослабленными или даже изменившими свой знак напротивоположный [270, 271].Следует подчеркнуть, что экспериментальное наблюдение продольной скалярнойрелаксации и измерение ее скорости крайне затруднено из-за требования соизмеримостивеличины изменения протон-протонной скалярной константы в процессе химического обмена(ΔJAB = JA - JB) и разности соответствующих частот νоА - νоВ [58, P.
213‒216]. Это предполагаетсильносвязанность взаимодействующих протонов и незначительную разницу их химическихсдвигов: в пределах 0.02 – 0.03 м.д. на частоте 300 МГц. Одновременное выполнениедостаточно противоречивых требований для проявления скалярной релаксации и сложность еерегистрации при небольшой разнице химических сдвигов являются основной причинойнебольшого числа доказанных примеров.
Один из наиболее известных первых таких примеровбыл обнаружен в 1968 году при изучении ЯЭО между гидроксильным и метильнымипротонами в метаноле, в котором при рН 3 наблюдался максимальный отрицательный эффектдо -85% [272]. Через год аналогичный эффект эти же авторы наблюдали в этаноле [273]. Из-зазначительного различия ларморовых частот в гетероядерных системах известен лишь одинпример наблюдения скалярной релаксации между разными магнитными ядрами в молекулеНF [274], которая происходит исключительно благодаря очень большой константе 1JН-F = 615Гц.
При оптимальных условиях обменная модуляция этой константы на частоте 90 МГц дляядер 1Н приводит в зависимости от скорости обмена к отрицательному усилению до 70%намагниченности ядер19F. Еще один пример был представлен в работе [275] поконформационному анализу с помощью ЯЭО 2,4-динитрофенола в тетрагидрофуране начастоте 60 MГц. Несмотря на сравнительно слабый отрицательный эффект Оверхаузера междуфенольным протоном и протоном в мета-положении, а также на небольшую величинускалярной константы между этими протонами (0.4 Гц), авторы пришли к заключению, что зааномальный ЯЭО ответственен скалярный механизм релаксации 1-го рода, связанный собразованием в исследуемой молекуле внутримолекулярной водородной связи.
Хотятеоретическое обоснование возможности реализации в 2,4-динитрофеноле скалярногомеханизма было дано в работе [276], возникает вопрос в отношении выполнениянеобходимого условия сильносвязанности между взаимодействующими протонами при43величине константы 0.4 Гц на частоте 60 МГц.Аналогичный вопрос о зависимости скалярного вклада в скорость кросс-релаксации отрабочей частоты спектрометра рассматривался в работе [277] для случая макромолекул,находящихся в условиях приближения спиновой диффузии (ωоτс >> 1).
Ее авторы наосновании сопоставления экспериментальных и расчётных вкладов диполь-дипольного искалярного механизмов релаксации в ЯЭО на частотах 90 и 250 МГц пришли к выводу, чтопри выполнении указанных условий скалярный механизм релаксации 1-го рода уменьшается сувеличением рабочей частоты ЯМР-спектрометра и, следовательно, его вклад в ЯЭО длябольших молекул не может играть существенной роли. Этот вывод вполне предсказуем подвум независимым причинам.
Во-первых, с увеличением частоты спектрометра степеньсильносвязанности между протонами уменьшается и, следовательно, уменьшается вкладскалярной релаксации 1-рода в скорость кросс-релаксации. Во-вторых, для больших молекулпри условии ωоτс >> 1 диполь-дипольный и скалярный механизмы имеют одинаковый поамплитуде отрицательный вклад в ЯЭО. Следовательно, на фоне диполь-дипольного вкладанаблюдается лишь небольшое дополнительное увеличение скорости кросс-релаксации за счетскалярного механизма релаксации.Совершенно иная ситуация реализуется для малых молекул в условиях экстремальногосужения линий (ωоτс << 1), в которых конкуренция неодинаковых по амплитудеположительного диполь-дипольного вклада и отрицательного скалярного вклада в скоростькросс-релаксации может приводить к более заметным эффектам в виде, например,значительного ослабления наблюдаемого ЯЭО или даже к изменению его знака напротивоположный [244, 270, 271].
Совершенно очевидно, что наблюдать конкуренцию двухразных механизмов релаксации лучше на сравнительно низких частотах ~300-400 MГц, прикоторыхсильносвязанностьмеждувзаимодействующимипротонамиповышаетотносительный вклад скалярного механизма [278, 279]. Более того, на высоких частотахначинает возрастать роль релаксации анизотропии химического сдвига (CSA – Chemical ShiftAnisotropy), которая не имеет никакого отношения к кросс-релаксации, но являетсядополнительным механизмом внешней релаксации и приводит к ослаблению всех сигналов вспектре NOESY [280].Несмотря на крайне ограниченное число литературных примеров доминированияскалярной релаксации первого рода, есть все основания предполагать, что это явлениераспространено значительно больше, чем это удается экспериментально доказать.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
