Диссертация (1145465), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Таким образом, эксперименты по измерению ЯЭО содержат в себеинформацию, как о пространственном строении молекул, так и об их внутримолекулярнойдинамике в растворе [186, 187]. Эта возможность непосредственным образом следует изформулы, связывающей скорость кросс-релаксации σijдля изолированной системы двухмагнитных ядер, находящихся в составе одной молекулы на фиксированном расстоянии rijдруг от друга. Если диффузионное движение этой молекулы в растворе изотропно, то ономожет быть охарактеризовано одним временемкорреляции τс и при условии ωоτс << 1получаем [188]:σij = 5α,/7/где α = 0.1γ4ħ2 = 56.92 Å6ns-2. В данном случае время корреляции τс определяетсятолькообщимдиффузионнымдвижениеммолекулы.Еслидополнительновнутримолекулярная подвижность с характеристическим временемτсвн.,имеетсято в формуле /7/вместо τс должно появиться эффективное время корреляции τсэфф., которое определяетсяследующим образом:(τсэфф.)-1 = (τс)-1 + (τсвн.)-1/8/Следовательно, зарегистрировать внутримолекулярную подвижность можно только вслучае соизмеримости скоростей внутримолекулярной подвижности и диффузии молекул.Если внутримолекулярная подвижность медленнее скорости диффузии, то зарегистрироватьее можно путем измерения эффективного расстояния < rij > по формуле /6/.
Это простой, нокрайне важный для данной работы вывод, поскольку внутримолекулярная динамика встероидных молекулах представляет собой инверсию циклогексановых колец и протекает созначительноменьшимискоростями,чемобщеедиффузионноедвижение.Поэкспериментальным оценкам скорость диффузии таких молекул в растворе хлороформа прикомнатной температуре составляет примерно 0.3·1011 Гц, что на 1.5 – 2.0 порядка вышерабочей частоты спектрометра (300 МГц), на котором проводились измерения спектровNOESY.Формула /7/ дает простой способ определения межпротонных расстояний, если хотя быодно из них известно.
Такое расстояние используется как эталонное, а любое неизвестноерасстояние rij вычисляется по формуле /9/:rij = rэт.эт../9/При получении этой формулы предполагалось, что времена корреляции диффузионного27движения τс для эталонного и измеряемого расстояний одинаковы. Следовательно, в этомслучае диффузионное движение изотропно. Если условие изотропности диффузии невыполняется, то вычисление расстояний калибровочным методом должно выполняться поформуле /10/:rij = rэт.эт.с эт.,/10/Таким образом, появляются еще две неизвестных величины, определение которыхтребует дополнительных усилий. По всей вероятности необходимость дополнительныхизмерений времен корреляции τсэт.
и τсij является основным объяснением, почему при оценкемежпротонных расстояний в малых молекулах (ωоτс << 1) калибровочный методиспользовался исключительно в приближении изотропного движения [189], т.е. сиспользованием соотношения /7/. Кроме того, следует учитывать, что до середины 90-х гг. небыла решена проблема релаксационной задержки (D1 > 5T1max.) и почти все количественныеоценки расстояний основывались на анализе одномерных экспериментов NOE-difference.Следовательно, число расстояний в одной малой молекуле, которое определялось такимспособом, было ограниченным.
В то же самое время аналогичные работы по определениюрасстояний в макромолекулах проводилось преимущественно в двумерном варианте спомощью спектроскопии NOESY или ROESY.Ключевой в данном отношении стала работа 1989 года [190], в которой былипроанализированы все основные экспериментальные проблемы и даны рекомендации для ихчастичного или даже полного устранения. Основная заслуга авторов этой работы заключаетсяв том, что они показали реальную возможность использования спектроскопии NOESY дляколичественных оценок межпротонных расстояний в малых молекулах, для которыхвыполняется условие ωоτс << 1.
Данная работа значительно повысила интерес кколичественным оценкам скоростей кросс-релаксации. Это рекомендовалось делать спомощью измерения при различных временах смешивания не абсолютных значенийинтегральныхинтенсивностейкросс-пиковSij,аихотношениякинтегральныминтенсивностям диагональных пиков Sii, что предполагало построение зависимости:= ƒ(τm) или = ƒ(τm)./11/Приведенные интегральные интенсивности в соотношении /11/ не должны зависеть отрелаксационного затухания сигналов и, следовательно, они представляют собой линейнуюзависимость от времени смешивания τm. Тогда искомая скорость кросс-релаксации σij можетбыть определена как тангенс угла наклона этой линейной зависимости к оси ординат.
Если28времена продольной релаксации спинов “i” и “j” значительно отличаются, то авторы работы[190] советовали воспользоваться соотношением /12/, которое усредняет это различие:Следуетзаметить,что приведенныеƒзначения/12/интегральныхинтенсивностейиспользовались задолго до этой работы, но только для макромолекул в условиях ωоτс >> 1[191, 192].Поэтому заслуга авторов работы [190] состоит в том,что они предложилиодновременно c использованием относительных величин в 2 – 3 раза сократить времярелаксационной задержки, справедливо предполагая, что относительные величины не будуттак критичны к ее длительности, как абсолютные. Дополнительно к этому они посчиталиважным работать с фиксированным общим временем эксперимента для различных значенийτm.
Это позволяет избавиться от систематических вкладов, вносимых внешней релаксацией, впогрешность измерения объемных интегралов. На теоретическом и экспериментальномуровне проблема релаксационной задержки при количественных измерениях спектров NOESYмалых молекул была решена позднее в работах [193, 194]. Такие эксперименты былопредложено называть Fast NOESY или еще короче – F.NOESY. Вклад в погрешность,связанный с неполной релаксацией спинов, в этих экспериментах не превышает ±3%. Следуетзаметить, что проблема сокращения общего времени эксперимента начала изучаться еще всередине 80-х годов для одномерных селективных методов измерения ЯЭО в работах [195,196].
Для обозначения таких одномерных экспериментов, также как позднее и двумерных, былвведен специальный термин “Truncated NOE” или просто “TNOE”, которые на русский языкможно перевести как “укороченный”, “урезанный” или “сокращенный”.Уже через 3 года после выхода статьи [190] появились несколько работ, в которых былаиспользована предложенная методология измерения межпротонных расстояний [197‒199]. ВэтихработахсравнивалисьрезультатыЯМРанализасданнымимолекулярногомоделирования и/или РСА. Поскольку все результаты в этих работах были представлены ввиде таблиц, то по отдельным парам сравниваемых расстояний очень сложно уловить общийуровень их совпадения или характер их расхождений.
Поэтому табличные цифровые данныепереведены в более наглядную форму корреляционных зависимостей, которые показаны нарисунке 1-4.В представленных на этом рисунке результатах первых работ по определениюмежпротонных расстояний в малых молекулах соединение (II) является наименее жестким, астероидные молекулы (III) и (IV) оказываются более конформационно жесткими посравнению с (II). Поэтому хорошо заметные заниженные значения ЯМР-расстояний для29достаточно большого числа экспериментальных точек по сравнению с данными расчетовмолекулярной динамики (МD) являются характерным отражением внутримолекулярнойподвижности молекулы (II). Однако, заниженные ЯМР-расстояния наблюдаются и длянекоторых пар протонов в жестких молекулах (III) и (IV) по сравнению, соответственно, срезультатами расчетов (MD) и данными РСА. Эти отклонения значительно превышаютграницы погрешностей ±5%, которые на всех графиках показаны пунктирными линиями.Рис. 1-4.
Сопоставление межпротонных расстояний, полученных на основе ЯЭО, c даннымимолекулярной динамики (MD) - для молекул (II) и (III) и данными РСА – для молекулы (IV).Пунктирными линиями показано отклонение ±5% от измеряемой величины3. Использованыданные для (II) - из работы [197], для (III) и (IV) – из работы [199].Таким образом, независимо от степени внутримолекулярной подвижности наблюдаетсяодинаковая тенденция: r (ЯЭО) < r (MD), r(РСА). К этому следует добавить, что во всех трехслучаях в качестве эталонного расстояния было выбрано значение 1.78 Å для парыгеминальных протонов.
Авторы работы [199] отметили данный факт в виде некоторогоправила, заключающегося в том, что если в качестве эталонного расстояния выбираетсянаиболее короткое из всех возможных, то измеряемые расстояния тоже оказываютсязаниженными. Но никаких объяснений этой “закономерности” дано не было.Соединение (II) в дальнейшем было использовано авторами в качестве модельного в 3Здесь и далее в аналогичных корреляционных графиках пунктирными линиями показано отклонение ±5%.30работах по изучению влияния неполной релаксационной задержки и для тестированияэкспериментов Fast NOESY [193, 194]. Представленные на рис.
1-4 результаты по измерениюмежпротонных расстояний в малых молекулах показали возможность таких оценок наколичественном уровне, но вместе с тем совершенно очевидной стала проблема выбораэталонного расстояния в жестких стероидных молекулах. Кроме того, оставались открытымивопросы, связанные с так называемыми эффектами 3-го спина (или с геометрическимфактором) и правомерностью использования для расчетов расстояний соотношения /9/,соответствующего сферической молекуле.В период появления первых работ по количественному определению межпротонныхрасстояний в малых молекулах автор данной работы только начинал знакомство с ЯМРспектроскопией стероидных молекул.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
